Peaje

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4895 (2023) Citar este artículo

1663 Accesos

16 altmétrica

Detalles de métricas

El hongo patógeno oportunista Cryptococcus neoformans causa infecciones letales en pacientes inmunocomprometidos. Los macrófagos son fundamentales para la respuesta del huésped a los criptococos; sin embargo, no está claro cómo los macrófagos reconocen y fagocitan C. neoformans. Aquí investigamos el papel de TLR4 en la fagocitosis no opsónica de C. neoformans. Encontramos que la pérdida de la función TLR4 aumenta inesperadamente la fagocitosis de criptococos no opsonizados por macrófagos murinos y humanos. El aumento de la fagocitosis observado en las células Tlr4-/- se mitigó mediante el tratamiento previo de los macrófagos con LDL oxidado, un ligando conocido de los receptores eliminadores. El receptor eliminador, el receptor eliminador de macrófagos 1 (MSR1) (también conocido como SR-A1 o CD204) estaba regulado positivamente en los macrófagos Tlr4-/-. La ablación genética de MSR1 dio como resultado una disminución del 75% en la fagocitosis de criptococos no opsonizados, lo que sugiere fuertemente que es un receptor no opsónico clave para este patógeno. Continuamos mostrando que la captación mediada por MSR1 probablemente implica la formación de un complejo de señalización multimolecular que involucra a FcγR que conduce a la activación de SYK, PI3K, p38 y ERK1/2 para impulsar la remodelación de actina y la fagocitosis. En conjunto, nuestros datos indican un papel hasta ahora no identificado para la diafonía TLR4/MSR1 en la fagocitosis no opsónica de C. neoformans.

Cryptococcus neoformans es una levadura encapsulada que causa infecciones potencialmente mortales en humanos y otros animales1,2, con una carga global estimada de 181.000 muertes al año3. La infección por C. neoformans comienza con la inhalación de células fúngicas del medio ambiente hacia los pulmones1. Dentro de los pulmones, los macrófagos residentes en los tejidos se encuentran entre las primeras células inmunitarias que encuentran los hongos4, por lo que se cree que la interacción entre los macrófagos del huésped y los hongos invasores es un determinante importante de la progresión y el resultado de la enfermedad. Los criptococos no opsonizados se fagocitan mal5, pero dado que los anticuerpos opsonizantes son insignificantes dentro del pulmón sano6, este bajo nivel de captación no opsonizante es probablemente un determinante crítico del curso posterior de una infección. Sin embargo, no existe una comprensión clara del mecanismo por el cual los macrófagos detectan y fagocitan C. neoformans en ausencia de opsoninas4,7.

La fagocitosis, definida como la absorción de partículas superiores a 0,5 μm, es un proceso importante en la respuesta inmune innata ya que conduce a la degradación de patógenos invasores y la presentación de ligandos microbianos en las moléculas del MHC, activando así el brazo adaptativo del sistema inmunológico8 . La fagocitosis no opsónica se inicia mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en la superficie de los microbios por parte de los receptores de reconocimiento de patrones del huésped (PRR)8. Los PRR en fagocitos profesionales incluyen miembros de la familia de receptores tipo Toll (TLR), la familia de receptores de lectina tipo C (CLR) y la familia de receptores carroñeros (SR). Todos estos han sido implicados en el reconocimiento de C. neoformans en diversos grados, con β-1,3-glucanos, mananos y glucuronoxilomanano (GXM) encontrados en la pared celular y cápsula de C. neoformans que sirven como PAMP9,10,11. 12,13,14,15. El CLR, Dectin-1 (también conocido como CLEC7A), es bien conocido por su papel en el reconocimiento de β-glucanos fúngicos11 y ha sido identificado como el PRR clave involucrado en la fagocitosis de Candida albicans16,17. Sin embargo, trabajos anteriores encontraron que Dectin-1 participa sólo marginalmente en la fagocitosis de C. neoformans no opsonizado5, lo que sugiere que otros receptores no opsónicos para C. neoformans pueden ser más importantes.

Dentro de la familia TLR, se sabe que TLR4 reconoce mananos fúngicos12 y GXM9, lo que lleva a la activación de cascadas de señalización posteriores. La señalización de TLR4 está mediada por las proteínas adaptadoras, la respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (MyD88) y el interferón-β inductor de adaptador que contiene el dominio TIR (TRIF) 18. Todos los TLR utilizan la vía dependiente de MyD88 excepto el TLR3, que en su lugar utiliza señalización dependiente de TRIF19,20. La vía dependiente de MyD88 y la vía dependiente de TRIF conducen en última instancia a la activación del factor de transcripción nuclear κB (NF-κB) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK)20. La vía TRIF también conduce a la activación del factor regulador de interferón 3 (IRF3). Estos actúan entonces activando la expresión y secreción de citocinas proinflamatorias (vía MyD88 y TRIF) y de interferones tipo I (vía TRIF)8,18,21. En particular, los TLR de la membrana plasmática también activan Rap GTPasa y Rac GTPasa para activar las integrinas fagocíticas y otros receptores fagocíticos auténticos que luego son responsables de la absorción de patógenos22.

Mientras investigamos el papel de la señalización de TLR en la respuesta inflamatoria a los criptococos, hicimos el descubrimiento inesperado de que la pérdida de la actividad de TLR4 conduce a una mayor absorción no opsónica del hongo. Mostramos que este aumento en la captación fue impulsado por la interferencia entre TLR4 y el receptor 1 del eliminador de macrófagos (MSR1) (también conocido como SR-A1 o CD204), de modo que la pérdida de señalización de TLR4 condujo a una expresión elevada de MSR1 en la superficie celular, pero no otras RS, lo que lleva a una mayor aceptación. Proporcionamos evidencia de que MSR1 es un receptor importante para la fagocitosis no opsónica de C. neoformans, arrojando luz sobre un receptor clave del huésped involucrado en la absorción de este hongo patógeno.

Para investigar el papel de TLR4 en la fagocitosis de C. neoformans no opsonizado, se trataron macrófagos murinos J774A.1 con TAK-242 0,2 ​​μM, un inhibidor de la señalización de TLR4, durante 1 h antes de infectarlos con C. neoformans todavía en el presencia del inhibidor. Sorprendentemente, la inhibición de TLR4 resultó en un aumento de 1,7 veces en la fagocitosis de los criptococos no opsonizados (Fig. 1a). Probamos si la pérdida genética de TLR4 replicaría este efecto mediante el uso de macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea (iBMDM) aislados de ratones de tipo salvaje y Tlr4-/- C57BL/6. Al igual que con la inhibición química de TLR4, la eliminación genética de TLR4 condujo a un aumento pronunciado de 8 veces en la fagocitosis de C. neoformans no opsonizado (Fig. 1b, d). Para examinar la relevancia humana de este hallazgo, se privó de suero a los macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) durante 2 h, se los pretrató con TAK242 0,2 ​​μM y se los infectó con C. neoformans. De manera similar al hallazgo en líneas celulares de ratones, la pérdida de señalización de TLR4 condujo a un aumento en la fagocitosis no opsónica de C. neoformans (Fig. 1c).

Se trataron macrófagos J774A.1 o (c) macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) con DMSO (control) o TAK-242 0,2 ​​μM, un inhibidor específico de TLR4, durante 1 h antes de la infección con C. neoformans no opsonizado. b Los macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea (iBMDM) de macrófagos de tipo salvaje y Tlr4 -/- se infectaron con C. neoformans no opsonizado. La fagocitosis se cuantificó como el número de criptococos internalizados individuales dentro de 100 macrófagos. Las cifras son representativas de al menos tres experimentos independientes. Los datos de HMDM representan dos experimentos independientes con donantes separados. d Imagen representativa que muestra la fagocitosis de C. neoformans (Cn-GFP) marcada con GFP por iBMDM de tipo salvaje y Tlr4-/-. Se utilizó calcoflúor blanco (CFW) para teñir hongos extracelulares. Las flechas blancas muestran hongos fagocitados. Barra de escala = 10 μm. La proliferación intracelular (IPR) de C. neoformans se midió en (e) macrófagos J774A.1 y (f) iBMDM de tipo salvaje y Tlr4 -/- utilizando imágenes de lapso de tiempo. Las imágenes se capturaron cada 5 minutos durante 18 h. Se cuantificó el número de hongos internalizados por 100 macrófagos en el "primer cuadro" (T0) y el "último cuadro" (T10) y el IPR se determinó mediante la ecuación: IPR = T10/T0. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Todos los datos se muestran como media ± SEM; n = 3 por condición; la significación estadística se evaluó mediante una prueba t bilateral no pareada; Los valores P se muestran encima de cada gráfico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se ha demostrado que las respuestas proinflamatorias, como las impulsadas por TLR4, restringen la proliferación intracelular de criptococos23, por lo que consideramos que el aumento percibido en la fagocitosis podría reflejar una mayor proliferación en ausencia de actividad de TLR4. Para probar esta hipótesis, realizamos imágenes en vivo de macrófagos infectados y cuantificamos la cantidad de hongos internalizados al comienzo del video (T0) y 10 h después de la infección (T10) para determinar la tasa de proliferación intracelular (IPR). Este ensayo de IPR basado en lapso de tiempo reveló que ni la inhibición de TLR4 usando TAK-242 (Fig. 1e) ni la desactivación de TLR4 (Fig. 1f) alteraron el IPR de los criptococos en comparación con los macrófagos de control. Esto sugiere que la carga intracelular observada de C. neoformans es representativa de la tasa inicial de absorción y no se debe a diferencias en la proliferación posterior de los hongos dentro de los macrófagos.

Habiendo demostrado que el aumento de la carga intracelular de infección después de la inhibición o eliminación de TLR4 es el resultado de una fagocitosis elevada y no de una proliferación, a continuación buscamos identificar el receptor de la membrana plasmática responsable de este aumento en la captación. Es de destacar que los TLR de la membrana plasmática no son receptores fagocíticos auténticos, ya que no son directamente responsables de la fagocitación de microorganismos completos22. En consecuencia, consideramos si TLR4 modula la disponibilidad de uno o más receptores fagocíticos que luego se unen a C. neoformans no opsonizado.

Los receptores carroñeros, una familia de receptores que se identificaron inicialmente por su papel en la captación de lipoproteínas modificadas del huésped24, están siendo implicados cada vez más como receptores para una variedad de microbios y sus ligandos25,26,27. Además, se ha demostrado que la expresión de varios receptores carroñeros está regulada positivamente en ratones Tlr4-/-28 y que los agonistas de TLR aumentan la fagocitosis de Escherichia coli al inducir la expresión de receptores carroñeros29. Por lo tanto, probamos si la pérdida de señalización de TLR4 aumenta la fagocitosis de C. neoformans no opsonizado a través de la regulación positiva de los receptores carroñeros.

En primer lugar, tratamos los macrófagos con lipoproteína oxidada de baja densidad (ox-LDL), un ligando del receptor eliminador general e inhibidor competitivo, antes de la infección con C. neoformans. Descubrimos que ox-LDL podía inhibir competitivamente la fagocitosis de C. neoformans tanto en macrófagos de tipo salvaje como en Tlr4 -/- (Fig. 2a, b). Cuando los macrófagos se infectaron con hongos opsonizados con anticuerpos 18B7 para impulsar la captación a través de los receptores Fcγ, el tratamiento previo con ox-LDL no tuvo impacto en la fagocitosis de los criptococos tanto en macrófagos de tipo salvaje como en Tlr4-/- (Fig. 2c), lo que indica que la inhibición es específica de la captación no opsónica. De manera similar al hallazgo en una línea celular murina, los HMDM pretratados con ox-LDL también mostraron una fagocitosis reducida de C. neoformans no opsónico (Fig. 2d), aunque no tan significativa como en las células de ratón, lo que implica que los receptores carroñeros son receptores ampliamente relevantes. implicado en la captación de C. neoformans.

a iBMDM de tipo salvaje (n = 6 por condición), b iBMDM Tlr4-/- (n = 6 por condición) y d macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) (n = 3 por condición) se trataron con lipoproteínas de baja densidad oxidadas ( ox-LDL), un ligando del receptor eliminador general, durante 30 minutos antes de la infección con C. neoformans no opsonizado. Los datos de iBMDM se combinan a partir de dos experimentos independientes. Los datos de HMDM representan dos experimentos independientes con donantes separados. c Los iBMDM de tipo salvaje y Tlr4-/- (n = 3 por condición) se trataron con 10 μg/ml de ox-LDL durante 30 minutos y luego se infectaron con C. neoformans opsonizado con el anticuerpo anticapsular 18B7. El número de hongos internalizados por 100 macrófagos se cuantificó a partir de imágenes de microscopía fluorescente. Los datos representan dos experimentos independientes. Todos los datos se muestran como media ± SEM; la significación estadística se evaluó mediante una prueba t bilateral no pareada (a, b, d); o ANOVA de dos vías seguido de la prueba post-hoc de Tukey (c). Los valores P se muestran encima de cada gráfico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El LDL oxidado es un receptor para una variedad de receptores eliminadores; por lo tanto, para discernir qué receptor(es) carroñero(s) específico(s) puede(n) ser responsable(s) de la fagocitosis de C. neoformans, analizamos la expresión superficial de los receptores carroñeros CD36, el receptor macrófago con estructura colagenosa (MARCO) y el receptor carroñero 1 de macrófagos (MSR1). , también conocido como SR-A1 o CD204, mediante citometría de flujo. Los macrófagos de tipo salvaje y Tlr4 -/- expresan altos niveles de CD36 (Fig. 3a; Fig. 1a complementaria); sin embargo, dado que el nivel de CD36 es similar entre los macrófagos de tipo salvaje y Tlr4-/-, no puede ser responsable del nivel diferencial de captación no opsónica entre estos dos tipos de células. Ambos tipos de células expresaron muy poco MARCO (Fig. 3b; Fig. complementaria 1b, eje x), de acuerdo con estudios que muestran que los iBMDM no expresan MARCO30. Sin embargo, cabe destacar que la expresión de MSR1 fue mayor en los macrófagos Tlr4 -/- en comparación con los macrófagos de tipo salvaje (Fig. 3c; Fig. complementaria 1b, eje y), lo que sugiere que el aumento de la fagocitosis de C. neoformans observado en los macrófagos Tlr4 -/- puede deberse a su mayor expresión de MSR1.

Expresión superficial inicial de un CD36 teñido con anticuerpo CD36-BB515 anti-ratón; b Receptor de macrófagos con estructura colágena (MARCO) teñido con anticuerpo MARCO-fluoresceína anti-ratón; yc Receptor eliminador de macrófagos 1 (MSR1), también conocido como CD204, teñido con anticuerpo anti-CD204-PE de ratón en macrófagos de tipo salvaje y Tlr4-/-. La expresión del receptor se midió mediante citometría de flujo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes que dieron resultados similares. Los números sobre las puertas se refieren al porcentaje de células positivas para CD36, MARCO y MSR1. Se infectaron células d MPI, una línea celular de macrófagos murinos dependientes de GM-CSF no transformadas, aisladas de ratones de tipo salvaje, Msr1-/-, Marco-/- y MSR1/MARCO con doble knockout (DKO), con C no opsonizado. neoformanos. Los datos mostrados se combinan a partir de tres experimentos independientes (n = 9). Los datos son media ± SEM; la significación estadística se evaluó mediante un ANOVA unidireccional; Los valores P se muestran encima del gráfico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, para probar la participación directa de receptores carroñeros individuales en la fagocitosis de criptococos, infectamos células MPI (una línea celular de macrófagos murinos dependientes de GM-CSF no transformadas) derivadas de tipo salvaje, Msr1-/-, Marco-/- o MSR1. Ratones C57BL/6 con doble knockout (DKO) /MARCO con C. neoformans no opsonizado. Si bien la absorción por los macrófagos Marco-/- era indistinguible de las células de tipo salvaje, los macrófagos derivados de ratones Msr1-/- mostraron una disminución significativa del 75% en la fagocitosis de los criptococos no opsonizados (Fig. 3d). Los macrófagos con doble knockout mostraron un nivel similar de reducción en la captación que los macrófagos con knockout simple Msr1-/-, lo que sugiere que el fenotipo en las células con doble knockout probablemente se deba a la pérdida de MSR1 y no de MARCO. En particular, todavía observamos cierta captación no opsónica en MSR1 y macrófagos con doble desactivación, lo que implica un papel para uno o más PRR adicionales en la captación no opsónica de criptococos.

Para probar si la interferencia TLR4-MSR1 observada anteriormente también ocurrió en estas células MPI, expusimos células MPI de tipo salvaje al inhibidor de TLR4, TAK-242. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores, la inhibición de TR4 condujo a un aumento en la fagocitosis de los criptococos no opsonizados (Figura complementaria 2). Además, al utilizar microscopía confocal para visualizar la distribución de MSR1 en macrófagos Tlr4 -/- infectados, observamos cierta acumulación de MSR1 alrededor de copas fagocíticas que contienen criptococos (Figura complementaria 3).

Habiendo identificado la existencia de interferencia entre TLR4 y MSR1 en la fagocitosis no opsónica de C. neoformans, intentamos explorar el mecanismo de fagocitosis mediada por MSR1, así como el mecanismo de regulación de la actividad de MSR1 mediada por TLR4. Los receptores carroñeros carecen de un dominio de señalización intracelular claro. Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la internalización mediada por receptores eliminadores y la producción de citocinas proinflamatorias requieren correceptores y moléculas adaptadoras que conduzcan a la formación de complejos de señalización multimoleculares26. Dado que el aumento de la captación de C. neoformans en los macrófagos Tlr4-/- probablemente esté impulsado por el aumento de la expresión de MSR1 en estas células, utilizamos macrófagos Tlr4-/- como una herramienta para identificar posibles proteínas involucradas en la fagocitosis mediada por MSR1.

Existe evidencia de que la diafonía TLR-TLR modula la expresión de citoquinas31. En consecuencia, nos preguntamos si la diafonía TLR-TLR también puede influir en la fagocitosis de los criptococos. Trabajos anteriores han investigado cuatro TLR diferentes en el contexto de la infección por C. neoformans: TLR2, TLR3, TLR4 y TLR932,33,34. Para explorar la existencia de interferencia TLR-TLR, tratamos los iBMDM de tipo salvaje y Tlr4-/- con inhibidores de TLR2 (CU CPT22), TLR3 (inhibidor del complejo TLR3/dsRNA) y TLR9 (ODN 2088) antes de la infección con C. neoformanos. Aunque la inhibición de TLR2 y TLR9 no tuvo impacto en la captación no opsónica de C. neoformans, la inhibición de TLR3 condujo a una disminución en la captación por parte de los iBMDM de tipo salvaje (Fig. 4a). La fagocitosis mejorada observada en los macrófagos Tlr4 -/- fue amortiguada por la inhibición de TLR3, lo que resultó en una disminución del 42% en el número de hongos fagocitados, pero no después de la inhibición de TLR2 o TLR9 (Fig. 4b). Curiosamente, cuando los macrófagos se infectaron con C. neoformans opsonizado con el anticuerpo anticapsular 18B7, la deficiencia de TLR4 todavía resultó en un aumento en la captación, pero el efecto de la inhibición de TLR3 se perdió tanto en las células de tipo salvaje como en las Tlr4-/- (Fig. 4c). Por tanto, el papel de TLR3 en la modulación de la fagocitosis de C. neoformans es específico de la captación no opsónica.

Los iBMDM a Wildtype yb Tlr4 -/- se trataron con inhibidores químicos de TLR2, TLR3 y TLR9 durante 1 h, luego se infectaron con C. neoformans no opsonizado. Los datos se combinan a partir de tres experimentos independientes (n = 9 por condición). c Los iBMDM de tipo salvaje y Tlr4-/- se trataron con un inhibidor de TLR3 y luego se infectaron con C. neoformans opsonizado con el anticuerpo anticapsular 18B7 (n = 3 por condición). d, e Los macrófagos Tlr4-/- fueron pretratados con concentraciones óptimas y subóptimas de inhibidor de TLR3 y ox-LDL, individualmente y en combinación (n = 3 por condición). La fagocitosis se cuantificó como el número de criptococos internalizados dentro de 100 macrófagos. Los datos son representativos de dos experimentos independientes y se muestran como media ± SEM; La significación estadística se evaluó utilizando (a, b, d, e) ANOVA unidireccional o (c) ANOVA bidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Los valores P se muestran encima de cada gráfico. f Los iBMDM de tipo salvaje y Tlr4 -/- se trataron con DMSO al 0,025% (control) o inhibidor de TLR3 10 μM durante 1 h. La expresión de MSR1 (también conocida como CD204) se midió utilizando el anticuerpo monoclonal CD204-PE anti-ratón. Se utilizó IgG2a κ de rata marcada con PE como control de isotipo. Las muestras se pasaron por un citómetro de flujo y se analizaron en el software FlowJo. Los porcentajes se refieren al porcentaje de células positivas para MSR1. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para explorar la conexión entre TLR3 y los receptores carroñeros, los iBMDM Tlr4-/- se trataron previamente con TLR3i y ox-LDL individualmente y en combinación. Primero tratamos los macrófagos con concentraciones efectivas de TLR3i (10 μM) y ox-LDL (10 μg/mL) y descubrimos que el tratamiento combinado no amortiguaba la fagocitosis más que los tratamientos individuales (Fig. 4d). Esto sugiere que los receptores TLR3 y depuradores actúan a lo largo de la misma vía, o que estas concentraciones de los inhibidores respectivos se están saturando, lo que no produce una mayor supresión cuando se usan ambos inhibidores.

A continuación, inspirados por un estudio que demostró que los ratones heterocigotos simples Msr1+/- o Tlr4+/- no mostraron deterioro en la fagocitosis de E. coli, pero los heterocigotos dobles eran defectuosos en la fagocitosis35, luego probamos si se usaba una concentración más baja de ox-LDL y TLR3i individualmente y en combinación darían como resultado una sinergia. Cuando los macrófagos Tlr4 -/- se trataron con TLR3i 1 μM o 1 μg / ml de ox-LDL, no hubo diferencias en la fagocitosis de C. neoformans en comparación con las células no tratadas (Fig. 4e). Sin embargo, cuando se trataron con 1 μM de TLR3i y 1 μg/ml de ox-LDL juntos, hubo una disminución en la fagocitosis (Fig. 4e). Concluimos que ambos receptores actúan en sinergia a lo largo de la misma vía, ya que el "flujo" residual a través de la vía cuando se usa una dosis baja de inhibidor se vio atenuado aún más por el tratamiento con ambos inhibidores.

Una posible interpretación de los datos presentados anteriormente sería un modelo en el que la pérdida de la señalización de TLR4 desencadena una mayor señalización de TLR3, lo que lleva a una regulación positiva de los receptores carroñeros. Para probar esta hipótesis, medimos la expresión de MSR1 en iBMDM de tipo salvaje y Tlr4 -/- después de 1 h de inhibición de TLR3. Sin embargo, no encontramos cambios significativos en la expresión de MSR1 después de que los macrófagos de tipo salvaje y Tlr4 -/- fueron tratados con el inhibidor de TLR3 (Fig. 4f), lo que sugiere que la interacción entre MSR1 y TLR3 no está al nivel de regulación directa mediada por TLR3. de expresión de MSR1.

La señalización de TLR4 y TLR3 requiere las moléculas adaptadoras posteriores MyD88 (utilizadas por TLR4) y TRIF (utilizadas tanto por TLR4 como por TLR3)20. Por lo tanto, para comprender las vías de señalización implicadas, los macrófagos se expusieron a inhibidores de MyD88, TRIF, IKKβ (una quinasa aguas abajo de MyD88 que es necesaria para la activación de NF-κB) y TBK1 (una quinasa aguas abajo de TRIF que fosforila). y activa IRF337). En los iBMDM de tipo salvaje, el tratamiento con los cuatro inhibidores condujo a una disminución de la fagocitosis no opsónica de C. neoformans (Fig. 5a). Asimismo, los cuatro inhibidores amortiguaron el aumento de la fagocitosis observado en los macrófagos deficientes en TLR4 (Fig. 5b). De acuerdo con los hallazgos de los tratamientos inhibidores, los macrófagos derivados de ratones Myd88 -/- y Trif -/- se vieron afectados en la fagocitosis de C. neoformans, observándose pocos o ningún evento de fagocitosis en estas células (Fig. 5c).

Los macrófagos a Wildtype y b Tlr4-/- fueron tratados con inhibidores de MyD88, IKKβ (una quinasa aguas abajo de MyD88 que es necesaria para la activación de NF-κB), TRIF y TBK1 (una quinasa aguas abajo de TRIF que fosforila y activa IRF3) ( n = 6 por condición). Después del tratamiento previo con los diversos inhibidores, las células se infectaron con C. neoformans no opsonizado. Los datos se combinan a partir de dos experimentos independientes. c Los BMDM inmortalizados de macrófagos de tipo salvaje, Tlr4-/-, MyD88-/- y Trif-/- se infectaron con C. neoformans no opsonizado (n = 3). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La fagocitosis se cuantificó como el número de criptococos internalizados dentro de 100 macrófagos. Los datos son media ± SEM y se analizan mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Los valores P se muestran encima de cada gráfico. d La expresión basal en la superficie del receptor 1 del eliminador de macrófagos (MSR1) (también conocido como CD204) se midió en macrófagos de tipo salvaje, Tlr4-/-, MyD88-/- y Trif-/- utilizando el anticuerpo CD204-PE anti-ratón. Se utilizó IgG2a κ de rata marcada con PE como control de isotipo. La expresión del receptor se midió mediante citometría de flujo y se analizó utilizando el software FlowJo. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los porcentajes se refieren al porcentaje de células positivas para MSR1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para garantizar que la pérdida de captación en macrófagos deficientes en MyD88 y TRIF no fuera causada por una deficiencia inherente en la capacidad fagocítica, infectamos iBMDM con CAF2-dTomato Candida albicans38. Descubrimos que los macrófagos MyD88-/- y Trif-/- tenían el mismo nivel de fagocitosis que los macrófagos de tipo salvaje (Figura complementaria 4). Por lo tanto, las vías no dependientes de TLR, como el receptor Dectin-1, que se reconoce como el PRR clave involucrado en la fagocitosis de C. albicans16,17, permanecen intactas en los macrófagos MyD88-/- y Trif-/-. Sin embargo, es de destacar que la pérdida de TLR4 también condujo a un aumento en la fagocitosis de C. albicans (Figura 4 complementaria), lo que sugiere la existencia de alguna respuesta compartida del huésped a ambos hongos. En general, la fagocitosis de C. neoformans no opsonizado, pero no de C. albicans, depende de la señalización de MyD88 y TRIF.

Dado que los macrófagos Myd88-/- y Trif-/- mostraron una pérdida casi completa de fagocitosis, planteamos la hipótesis de que estas células expresan muy poco MSR1. Para probar esto, también se midió la expresión superficial de MSR1 en estos macrófagos mediante citometría de flujo. Sin embargo, al igual que con los macrófagos Tlr4 -/-, las células Myd88 -/- y Trif -/- mostraron una mayor expresión de MSR1 en comparación con los iBMDM de tipo salvaje (Fig. 5d). Además, la proporción de células positivas para MSR1 en macrófagos Myd88-/- y Trif-/- fue similar a la observada en macrófagos Tlr4-/- (20,4% para el tipo salvaje, 71,8% para Tlr4-/-, 65,6% para MyD88-/ - y 74,9% para macrófagos Trif-/- (Figura complementaria 5)). Esto implica que el aumento de la expresión de MSR1 por sí solo no es suficiente para impulsar una mayor fagocitosis. Tanto MyD88 como TRIF o algunas otras moléculas dependientes de MyD88 y/o TRIF pueden servir como proteínas adaptadoras o correceptores necesarios para impulsar la absorción de patógenos.

Para continuar investigando los eventos de señalización posteriores que ocurren durante la absorción mediada por MSR1, llevamos a cabo una detección de inhibidores a pequeña escala utilizando macrófagos Tlr4-/-. Un estudio previo que investigó un receptor eliminador diferente, el CD36, demostró que CD36 forma un complejo de señalización que involucra FcγR, integrinas y tetraspaninas39. Aunque se sabe que los FcγR median en la fagocitosis de C. neoformans opsonizado con anticuerpos, inspirados en este trabajo anterior, probamos si también podrían estar involucrados en ayudar a la fagocitosis no opsónica a través de MSR1. Curiosamente, el bloqueo de FcγRII y FcγRIII utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 condujo a una disminución en la fagocitosis de los criptococos no opsonizados (Fig. 6a). Por lo tanto, es posible que MSR1 (que no tiene su propio dominio de señalización C-terminal) pueda activar señales posteriores utilizando el dominio de señalización de FcR coagrupados.

Los macrófagos Tlr4-/- fueron pretratados con inhibidores de a FcγR (n = 3 por condición), b SYK y PI3K (control, n = 6; tratamiento, n = 3) y c Proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) ( n = 3 por condición) durante 1 h, luego se infectaron con C. neoformans no opsonizado. El número de hongos internalizados por 100 macrófagos se cuantificó a partir de imágenes de un microscopio de fluorescencia. Las cifras son representativas de tres experimentos independientes. Los datos se muestran como media ± SEM; Se realizó un ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey para evaluar la significación estadística. Los valores P se muestran encima de cada gráfico. d Los iBMDM Wildtype y Tlr4-/- se expusieron a inhibidores de MAPK durante 24 h, luego se detectó la expresión de MSR1 en la superficie celular utilizando el anticuerpo CD204-PE anti-ratón. Se utilizó IgG2a κ de rata marcada con PE como control de isotipo. La expresión del receptor se midió mediante citometría de flujo y se analizó utilizando el software FlowJo. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los porcentajes se refieren al porcentaje de células positivas para MSR1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Al compromiso de los FcγR le sigue la fosforilación de sus motivos ITAM40, seguido del reclutamiento y activación de SYK. Aguas abajo de SYK se encuentra la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), una enzima modificadora de lípidos que cataliza la conversión de PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 en la membrana plasmática41. En última instancia, esto conduce a una variedad de respuestas biológicas que incluyen la remodelación del citoesqueleto de actina para impulsar la fagocitosis40,41. Dada la supuesta participación de los FcR en la captación mediada por MSR1, a continuación probamos la participación de estas quinasas posteriores en la fagocitosis no opsónica mediada por MSR1. Descubrimos que la inhibición de SYK usando piceatannol, o de PI3K usando wortmanina, condujo a una disminución dependiente de la dosis en la fagocitosis de criptococos por macrófagos (Fig. 6b). Esto implica un modelo en el que la unión de C. neoformans a MSR1 desencadena la formación de un complejo de señalización con FcγR. El dominio ITAM de FcγR permite la activación de SYK y PI3K, que luego impulsa la remodelación de actina y la internalización de hongos (Fig. 7).

TLR4 modula la expresión superficial de MSR1 a través de un mecanismo aún por identificar, de modo que la pérdida de señalización de TLR4 impulsa una mayor expresión superficial de MSR1. Esto puede ser mediante la modulación de la expresión del gen MSR1 o la modulación del tráfico del reservorio intracelular de MSR1 hacia la membrana plasmática. MSR1 es entonces responsable de la unión directa y la internalización de C. neoformans. La captación mediada por MSR1 puede depender de la formación de un complejo de señalización con FcγRII/III. El dominio ITAM de los FcγR permite la activación de SYK y PI3K, que luego activa las Rac GTPasas que impulsan la polimerización de actina y la fagocitosis. Al mismo tiempo, TLR3, MyD88 y TRIF también pueden servir como correceptores o proteínas adaptadoras que conducen a la activación de ERK1/2 y p38, que también impulsarán la remodelación de actina y la absorción de patógenos. Figura creada con BioRender.com.

Anteriormente se ha demostrado que los TLR inducen un programa de expresión de genes fagocíticos a través de la proteína quinasa p3829 activada por mitógenos, por lo que planteamos la hipótesis de que la mayor captación observada en los macrófagos Tlr4-/- puede depender de la señalización de MAPK. Para probar esta hipótesis, tratamos previamente los macrófagos con inhibidores de las tres MAPK clásicas, a saber, quinasas de señalización extracelular (ERK1/2), p38 y quinasa N-terminal c-Jun (JNK). ERK1/2 y p38, pero no JNK, estuvieron involucrados en la fagocitosis no opsónica (Fig. 6c). Las MAPK también están aguas abajo de la señalización de SYK y tienen una variedad de funciones efectoras que incluyen la producción de citocinas proinflamatorias y la remodelación del citoesqueleto42, lo que respalda el modelo propuesto en el que el reclutamiento de SYK en MSR1 a través de correceptores que contienen ITAM impulsa la internalización del ligando. La activación de MAPK también está impulsada por la señalización MyD88 y TRIF43. Dada la disminución de la captación observada después de la inhibición de MyD88 y TRIF (Fig. 5a, b) y en los macrófagos Myd88-/- y Trif-/- (Fig. 5c), en nuestro modelo, MyD88 y TRIF también funcionarían como proteínas adaptadoras para MSR1. -internalización mediada por ligando (Fig. 7).

Finalmente, nos preguntamos si la señalización de MAPK puede modular la expresión inicial de MSR1. Para probar esta hipótesis, los macrófagos de tipo salvaje y Tlr4-/- se trataron con inhibidores de MAPK durante 24 h, luego se midió la expresión de MSR1 mediante citometría de flujo. Sin embargo, no encontramos diferencias en la expresión de MSR1 después de la inhibición de ERK1/2, p38 o JNK en macrófagos de tipo salvaje o knockout (Fig. 6d).

Nuestros hallazgos proporcionan información sobre el papel de la diafonía TLR4-MSR1 en la fagocitosis de C. neoformans no opsonizada por macrófagos. Descubrimos que la pérdida de señalización de TLR4 aumentó inesperadamente la fagocitosis de C. neoformans al regular positivamente la expresión de MSR1, a través de un mecanismo aún por identificar. Utilizando macrófagos Msr1-/- demostramos que MSR1 es un receptor fagocítico clave para la captación de C. neoformans, lo que también explica por qué otros receptores no opsónicos, como el clásico receptor fúngico Dectin-1, parecen desempeñar un papel menos importante. en la respuesta del huésped a C. neoformans5,44. En particular, dado que todavía había casos de captación en macrófagos Msr1-/-, otros receptores no opsónicos también deben desempeñar un papel en la fagocitosis no opsónica de C. neoformans. Estos receptores aún están por identificar.

Los receptores carroñeros son receptores fagocíticos que se encuentran en la membrana plasmática de varias células inmunes, incluidos los macrófagos25. Se descubrió por primera vez que se unían a lipoproteínas de baja densidad (LDL) modificadas, pero ahora se sabe que reconocen una amplia gama de ligandos microbianos y del huésped, como células apoptóticas, fosfolípidos, proteoglicanos, LPS y β-glucanos fúngicos25,26,27. Anteriormente se ha informado que TLR4 tiene sinergia con MSR1 para promover la fagocitosis de E. coli gramnegativas, mientras que TLR2 tiene sinergia con MSR1 en la fagocitosis de Staphylococcus aureus grampositivos35. De manera similar, MSR1 participó en la fagocitosis de la bacteria Gram negativa Neisseria meningitidis, que también es reconocida por TLR4, al tiempo que modula la respuesta inflamatoria mediada por TLR4 a la infección por N. meningitidis45. Por lo tanto, nuestro descubrimiento de la diafonía TLR/MSR1 en el contexto de una infección fúngica sugiere que la diafonía TLR-SR como regulador de la fagocitosis y la expresión de citoquinas es un fenómeno general de las interacciones huésped-patógeno.

Los receptores carroñeros, incluido el MSR1, tienen colas citoplasmáticas muy cortas sin dominios de señalización discernibles26, por lo que se cree que actúan formando un complejo de señalización multimolecular. Utilizamos Tlr4-/- iBMDM como modelo para identificar socios potenciales en la fagocitosis mediada por MSR1. Primero identificamos un papel para TLR3, un PRR endosomal conocido por su papel como receptor de dsRNA43, en este proceso. La inhibición de TLR3 amortiguó la fagocitosis elevada observada en los macrófagos Tlr4-/-; sin embargo, la inhibición de TLR3 no influyó en la expresión de MSR1. Dado que TLR3 es un receptor de ARNbc, no existe un ligando de TLR3 obvio en C. neoformans, por lo que el mecanismo que impulsa la contribución de TLR3 a la modulación de la captación de C. neoformans por los macrófagos requiere más estudios.

A pesar de la disminución en la fagocitosis de C. neoformans observada en los macrófagos MyD88-/- y Trif-/-, también encontramos que los macrófagos deficientes en MyD88 y TRIF tenían una mayor expresión de MSR1 en comparación con los macrófagos de tipo salvaje. Esto sugiere que la presencia de MSR1 en la superficie celular por sí sola no es suficiente para impulsar la fagocitosis. Además, muestra que el papel de MyD88 y TRIF en la fagocitosis de C. neoformans no se debe a un impacto en la expresión de MSR1. En cambio, pueden funcionar como proteínas adaptadoras o activadores de alguna otra molécula asociada necesaria para la absorción exitosa de patógenos mediada por MSR1. Lo mismo podría decirse de TLR3, ya que el tratamiento con un inhibidor de TLR3 no tuvo impacto en la expresión de MSR1 a pesar de que la inhibición de TLR3 resultó en una disminución de la fagocitosis.

Una exploración más profunda de la fagocitosis mediada por MSR1 reveló un papel potencial para FcγRII y III al actuar junto con MSR1 en la superficie celular. Esto está en línea con trabajos anteriores que encontraron que los FcγR actúan junto con otro receptor eliminador, el CD3639. También demostramos que las quinasas posteriores a FcγR, como SYK y PI3K, y las quinasas posteriores a TLR3, MyD88 y TRIF, como ERK1/2 y p38, también participaron en la captación no opsónica. En conjunto, proponemos un modelo en el que TLR4 modula los niveles superficiales de MSR1. La modulación del MSR1 de la superficie celular puede estar al nivel de la regulación de la expresión de MSR1 mediada por TLR4. Alternativamente, puede representar un papel para TLR4 en la redistribución del reservorio intracelular de MSR1, de modo que la deficiencia de TLR4 impulsa el tráfico de MSR1 a la membrana plasmática. MSR1 es entonces responsable de la unión directa y la internalización de C. neoformans. El reconocimiento de C. neoformans por MSR1 desencadena la formación de un complejo de señalización con FcγR. El dominio ITAM de FcγR permite la activación de SYK y PI3K, que luego impulsa la remodelación de actina y la internalización de hongos. Al mismo tiempo, los TLR pueden enviar señales a través de MyD88 y TRIF para activar ERK1/2 y p38, lo que también impulsará la remodelación de actina y la absorción de patógenos.

Aunque exploramos la señalización de MSR1 a través de correceptores, no podemos descartar la posibilidad de una señalización directa de MSR1 a través de su cola citoplasmática. El MSR1 humano tiene una cola citoplasmática de 50 aminoácidos de largo (55 aminoácidos de largo en ratones). El análisis in silico de la secuencia de la proteína MSR1 revela la presencia de un residuo de serina conservado en humanos y ratones (serina 27 en humanos y serina 32 en ratones), que puede fosforilarse según UniProt46, lo que sugiere una cascada de fosforilación aguas abajo. De hecho, se ha demostrado que se necesita una asociación directa entre MSR1 y el receptor tirosina quinasa Mer para impulsar la captación de células apoptóticas por parte de los macrófagos47. De manera similar, la tirosina quinasa Lyn ha sido coinmunoprecipitada con MSR1 durante la absorción de LDL48 acetilada, lo que respalda la posibilidad de señalización directa mediada por MSR1.

El mecanismo de regulación de la expresión de MSR1 mediada por TLR4 sigue siendo difícil de alcanzar. Medimos la expresión de MSR1 después de la exposición a inhibidores de TLR3 y MAPK y en macrófagos MyD88-/- y Trif-/-. Ninguna de estas vías de señalización tuvo ningún efecto sobre la expresión de MSR1 a pesar de que desempeñaron un papel en la fagocitosis. Por lo tanto, el mecanismo de interferencia TLR4/MSR1 para modular la fagocitosis puede ser independiente del mecanismo que controla la expresión de MSR1. En particular, se ha demostrado que ERK1/2 modula la expresión de MSR1 inducida por LPS49, pero no la expresión de CD3650. Además, la señalización JAK-STAT moduló la expresión de MSR1 y CD36 después de la estimulación con LPS. No vimos ningún papel para ERK1/2 en la modulación de la expresión de MSR1 en nuestro estudio, probablemente porque no utilizamos estimulación con LPS en nuestro diseño experimental. En el futuro, será interesante investigar el mecanismo de expresión de MSR1 al inicio del estudio, sin estimulación con LPS, quizás mediante un enfoque basado en ómicas.

Otros han investigado el papel de TLR4 durante la respuesta del huésped a la infección por Cryptococcus; sin embargo, estos estudios han revelado resultados contradictorios9,32,51,52. Un estudio in vitro encontró que la estimulación de células microgliales aisladas del cerebro de ratones de tipo salvaje con el agonista de TLR4, lipopolisacárido (LPS), dio como resultado un aumento de la fagocitosis y la muerte de C. neoformans de una manera dependiente de MyD8853. Curiosamente, los estudios in vivo con ratones con deficiencia de TLR4 han descubierto que el receptor es prescindible durante la respuesta del huésped a la infección32,33,51. MyD88 es una molécula adaptadora clave aguas abajo de todos los TLR excepto TLR3. Los ratones deficientes en MyD88 muestran consistentemente que esta molécula adaptadora desempeña un papel importante en la respuesta inmune anti-Cryptococcus33,51, implicando así a los TLR aguas arriba en la respuesta del huésped. Sin embargo, hasta la fecha, no se comprende bien el papel preciso de los TLR individuales, incluido el TLR4, durante la infección criptocócica. Nuestros datos sugieren que una posible explicación para estos resultados contradictorios previos es el nivel variable de expresión de MSR1, que no se tuvo en cuenta en estos estudios. Aquí mostramos que la eliminación de TLR4 aumentó la expresión de MSR1; sin embargo, otros han demostrado que la estimulación de TLR4 mediada por LPS también era capaz de aumentar la expresión de receptores carroñeros, lo que conduce a una mayor captación29,49. A pesar de esperar que la deficiencia de TLR4 y el tratamiento previo con un agonista de TLR4 tengan efectos opuestos, nuestros datos implican que cualquier perturbación de la señalización de TLR4 afecta la expresión del receptor carroñero, lo que podría afectar la respuesta de los macrófagos a la infección.

Un estudio in vivo con ratones Msr1-/- encontró que los ratones knockout tenían una carga fúngica pulmonar reducida y una expresión disminuida de las citocinas T-helper 2 (Th2), que es un estado de polarización inmune que promueve el crecimiento y la diseminación de los hongos13. Así, los autores concluyeron que MSR1 normalmente es secuestrado por C. neoformans para promover su patogénesis. Si este es el caso, el aumento de la expresión de MSR1 que observamos en los macrófagos Tlr4-/- podría correlacionarse con malos resultados de la enfermedad. En apoyo de esta idea está el hallazgo de que los aislados clínicos de C. neoformans que se fagocitan más fácilmente mostraron una mayor carga fúngica cerebral, una reducción de la supervivencia de los ratones y una polarización hacia la respuesta Th2 no protectora54. De manera similar, los aislados clínicos con índices fagocíticos bajos se asociaron con una eliminación fúngica deficiente (incluso con tratamiento antimicótico) en el líquido cefalorraquídeo55. Mientras tanto, los aislamientos con índices fagocíticos altos se asociaron con una mayor mortalidad55,56. Por lo tanto, tanto la fagocitosis muy alta como la muy baja son predictores de un mal resultado de la enfermedad, lo que implica la existencia de un nivel de captación "Ricitos de oro". En última instancia, las estrategias para manipular la captación no opsónica de criptococos (quizás con inhibidores bloqueadores o (ant)agonistas de la vía de captación) pueden resultar un enfoque terapéutico útil para lograr ese nivel de "Ricitos de oro" en los pacientes, aunque dado que la captación no está impulsada por MSR1 solo, debemos considerar la contribución de otros PRR no opsónicos y la posible diafonía entre receptores. Además, también puede ser relevante explorar el efecto de los polimorfismos de MSR1 sobre la susceptibilidad a la meningitis criptocócica.

En resumen, aquí presentamos la importancia de la diafonía TLR4/MSR1 en la fagocitosis de C. neoformans no opsonizada, identificamos a MSR1 como un receptor crítico para la fagocitosis no opsónica de C. neoformans y proponemos un mecanismo mediante el cual la unión del ligando interactúa con MSR1. con correceptores como los FcγR para activar la señalización descendente.

Los conos de leucocitos utilizados para este estudio se obtuvieron con la aprobación ética del Comité de Revisión Ética de Ciencia, Tecnología, Ingeniería y Matemáticas de la Universidad de Birmingham (referencia de aprobación ERN15_0804c). Se obtuvo el consentimiento informado antes de la donación de sangre. Todas las muestras fueron completamente anónimas y destruidas después de la experimentación.

La línea celular J774A.1 [ECACC] se cultivó en matraces T-75 [Fisher Scientific] en medio Eagle modificado por Dulbecco, bajo en glucosa (DMEM) [Sigma-Aldrich], que contenía 10% de suero bovino fetal vivo (FBS) [Sigma- Aldrich], L-glutamina 2 mM [Sigma-Aldrich] y solución de penicilina y estreptomicina al 1% [Sigma-Aldrich] a 37 °C y 5% de CO2. Durante los ensayos de fagocitosis, se sembraron macrófagos J774A.1 a una densidad de 1 x 105 células por pocillo de una placa de 24 pocillos [Greiner Bio-One] y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5% de CO2.

Los macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea se aislaron originalmente de ratones knock-out simples C57BL/6, Tlr4-/-, MyD88-/- y Trif-/- y se inmortalizaron mediante transformación con retrovirus que expresan Raf y Myc, dos protovirus bien conocidos. -oncogenes57,58,59. Los BMDM inmortalizados se cultivaron en DMEM, bajo contenido de glucosa [Sigma-Aldrich] suplementado con FBS inactivado por calor al 10% [Sigma-Aldrich], L-glutamina 2 mM [Sigma-Aldrich] y solución de penicilina y estreptomicina al 1% [Sigma-Aldrich ] a 37 °C y 5% de CO2. Durante los ensayos de fagocitosis, se sembraron iBMDM a una densidad de 3 x 105 células por pocillo de una placa de 24 pocillos [Greiner Bio-One] veinticuatro horas antes de la infección. Luego, las células se incubaron durante la noche a 37 °C y 5% de CO2.

Las células del Max Plank Institute (MPI) son una línea celular de macrófagos murinos no transformados, dependientes del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), que es funcionalmente similar a los macrófagos alveolares30,60. En este estudio, se utilizaron células MPI de ratones C57BL/6 MSR1/MARCO con doble knockout (DKO) de tipo salvaje, Msr1-/-, receptor de macrófagos con estructura colagenosa desactivada (Marco-/-) y MSR1/MARCO doble knockout (DKO). Las células se cultivaron en medio 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) [ThermoFisher] suplementado con FBS inactivado por calor al 10% [Sigma-Aldrich], L-glutamina 2 mM [Sigma-Aldrich] y solución de penicilina y estreptomicina al 1% [Sigma -Aldrich] a 37 °C y 5% CO2. Cada matraz se complementó adicionalmente con medio RPMI acondicionado con GM-CSF al 1% vol/vol preparado usando la línea celular X-63-GMCSF. Cuando se utilizaron en ensayos de fagocitosis, las células MPI se sembraron a una densidad de 2 x 105 células por pocillo de una placa de 24 pocillos [Greiner Bio-One] con GM-CSF al 1% vol/vol. Luego, las células se incubaron durante la noche a 37 °C y 5% de CO2. Todas las líneas celulares utilizadas en esta investigación están disponibles comercialmente o a través de los autores.

Los conos de leucocitos, de donantes sanos, se obtuvieron del Servicio de Transfusión de Sangre del Servicio Nacional de Salud (NHSBT) y se procesaron rápidamente en 4 horas. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los conos utilizando un método de centrifugación en gradiente de densidad estándar. Después de un lavado con DPBS, la sangre se mezcló con un volumen igual de DPBS (que contenía 2 % de FBS) y se colocó cuidadosamente en capas sobre Lymphoprep (StemCell). La centrifugación se realizó a 1100 × g durante 20 minutos sin aplicar frenos. La capa leucocitaria blanca resultante se recogió y se lavó adicionalmente con DPBS centrifugando a 300 x g durante 10 minutos. Los glóbulos rojos (RBC) se eliminaron utilizando una solución de lisis de RBC (BioLegend) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se aislaron monocitos CD14+ de las PBMC mediante selección inmunomagnética positiva (Miltenyi Biotec). Los monocitos humanos aislados se sembraron a una densidad de 0,5 x 106 células por pocillo en placas de 24 pocillos tratadas con cultivo de tejidos y se cultivaron en medio RPMI 1640 completo suplementado con 10 % de suero humano y 20 ng/ml de GM-CSF humano (PeproTech). para la diferenciación de macrófagos. Las células se incubaron durante 6 días, con reemplazo del medio el día 3.

Se realizaron ensayos de fagocitosis para medir la absorción de Cryptococcus por los macrófagos en diversas condiciones. Veinticuatro horas antes del inicio del ensayo de fagocitosis, se realizó un cultivo nocturno de Cryptococcus neoformans var. La cepa grubii KN99α, que previamente había sido transformada biolísticamente para expresar la proteína verde fluorescente (GFP)61, se creó recogiendo una colonia de hongos de placas de agar YPD (50 g/L de caldo YPD en polvo [Sigma-Aldrich], 2 % de agar [ MP Biomedical]) y resuspender en 3 ml de caldo YPD líquido (50 g/l de caldo YPD en polvo [Sigma-Aldrich]). Luego, el cultivo se incubó a 25 °C durante la noche en rotación constante (20 rpm).

El día del ensayo, los macrófagos se activaron utilizando 150 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) [Sigma-Aldrich] durante 1 h a 37 °C. La estimulación con PMA se realizó en medios que contenían suero inactivado por calor (células iBMDM y MPI) o en medios sin suero (J774A.1) para eliminar la contribución de las proteínas del complemento durante la fagocitosis. Cuando se utilizaron macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM), los macrófagos M0 carecieron de suero durante 2 h. Cuando correspondía, los macrófagos se trataron con la concentración deseada de inhibidores solubles de PRR (Datos complementarios 1) y se incubaron a 37 ° C durante 1 h. Mientras tanto, se realizó un pretratamiento con el ligando del receptor eliminador general, lipoproteína oxidada de baja densidad (ox-LDL), durante 30 minutos. La concentración utilizada para cada molécula se indica en los Datos complementarios 1 y en los resultados correspondientes.

Para preparar C. neoformans para la infección, el cultivo de C. neoformans durante la noche se lavó dos veces en 1X PBS y se centrifugó a 6500 rpm durante 2,5 minutos. Para infectar macrófagos con C. neoformans no opsonizado, después del lavado final, el sedimento de C. neoformans se resuspendió en 1 ml de PBS, se contó usando un hemacitómetro y los hongos se incubaron con macrófagos a una multiplicidad de infección (MOI) de 10:1. . Se dejó que la infección se produjera durante 2 h a 37 °C y 5% de CO2. La infección se produjo en presencia de inhibidores solubles.

En algunos casos, los macrófagos se infectaron con C. neoformans opsonizado con anticuerpos. Para opsonizar los hongos, se opsonizaron 1 x 106 células de levadura en 100 μl de PBS durante 1 h utilizando 10 μg/ml de anticuerpo anticapsular 18B7 (un amable obsequio de Arturo Casadevall, Universidad Johns Hopkins, Baltimore, EE. UU.). Después de 2 h de infección, los macrófagos se lavaron 4 veces con PBS para eliminar la mayor cantidad posible de C. neoformans extracelular.

Después de eliminar los criptococos extracelulares, se cuantificó el número de hongos fagocitados mediante imágenes de un microscopio fluorescente. Para distinguir entre C. neoformans fagocitada y extracelular, los pocillos se trataron con 10 μg/ml de blanco de calcoflúor (CFW) [Sigma-Aldrich], un fluorocromo que reconoce la celulosa y la quitina en las paredes celulares de hongos, parásitos y plantas62, durante 10 minutos a 37 ºC. A continuación, se adquirieron imágenes de microscopía fluorescente utilizando el Zeiss Axio Observer [Zeiss Microscopy] equipado con la cámara ORCA-Flash4.0 C11440 [Hamamatsu] con un aumento de 20X. Se utilizó el objetivo de contraste de fase, el canal EGFP y el canal CFW. La adquisición de imágenes se realizó utilizando el software ZEN 3.1 Blue [Zeiss Microscopy] y las imágenes resultantes se analizaron utilizando el software de procesamiento de imágenes Fiji [ImageJ].

Para cuantificar el número de criptococos fagocitados, se contó el número total de C. neoformans ingeridos en 200 macrófagos, luego se aplicaron los valores a la siguiente ecuación: ((número de C. neoformans fagocitados/número de macrófagos) * 100). Por tanto, el resultado del ensayo de fagocitosis se presenta como el número de hongos internalizados por 100 macrófagos.

Para evaluar la tasa de proliferación intracelular (IPR) de C. neoformans dentro de los macrófagos, se capturaron macrófagos infectados en un intervalo regular durante un período prolongado. Las imágenes de células vivas se realizaron ejecutando el ensayo de fagocitosis como de costumbre, luego, después de lavar el criptococo extracelular, se volvió a agregar el medio correspondiente para la línea celular de macrófagos al pozo antes de la obtención de imágenes. Las imágenes en vivo se produjeron utilizando el Zeiss Axio Observer con un aumento de 20X y las imágenes se adquirieron cada 5 minutos durante 18 h a 37 °C y 5% de CO2.

Los vídeos resultantes se analizaron utilizando Fiji [ImageJ] y el IPR se determinó cuantificando el número total de hongos internalizados en 200 macrófagos en el "primer fotograma" (punto temporal 0 (T0)) y el "último fotograma" (T10). Luego, el número de hongos fagocitados en T10 se dividió por el número de hongos fagocitados en T0 para obtener el IPR (IPR = T10/T0).

Se utilizó inmunofluorescencia para investigar la localización del receptor en macrófagos. En primer lugar, se colocaron cubreobjetos de 13 mm en placas de 24 pocillos antes de sembrar con el número deseado de macrófagos. Después de una incubación durante la noche, se utilizaron macrófagos en un ensayo de fagocitosis estándar. Antes de la tinción, los macrófagos se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% diluido en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para evitar la unión no específica, las células se incubaron con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% diluida en 1xPBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para teñir la localización de MSR1, MSR1 anti-ratón de conejo (E4H1C) (1:100) [Tecnología de señalización celular; N.º de gato: 91119; Se utilizó el clon E4H1C] como anticuerpo primario. Las células se incubaron con el anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS, los macrófagos se incubaron con el anticuerpo secundario del fragmento F(ab')2 anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 594 (1:500) [Cell Signaling Technology; Cat#: 8889 S] durante 1 h a temperatura ambiente y en la oscuridad. Los cubreobjetos se montaron en 5 μL de medio de montaje antidecoloración VECTASHIELD HardSet con DAPI [Vector Laboratories]. Las imágenes se adquirieron utilizando el Zeiss LSM880 Confocal con Airyscan2, líneas láser de 405, 488, 561 y 640 nm y con un aumento de aceite de 63X. La adquisición de imágenes se realizó utilizando el software ZEN Black 3.0 [Zeiss Microscopy] y las imágenes resultantes se analizaron utilizando el software de procesamiento de imágenes Fiji [ImageJ].

Se utilizó citometría de flujo para medir la expresión superficial de receptores carroñeros en macrófagos. Antes de la tinción, los macrófagos se incubaron con un bloque Fc CD16/CD32 anti-ratón de rata de 2,5 µg/ml [BD Biosciences; N.º de gato: 553142; Clon 2.4G2] diluido en tampón FACS (1XPBS sin Mg2+ y Ca2+ suplementado con FBS al 2% inactivado por calor y EDTA 2 mM). Después del bloqueo de Fc, se añadió a cada tubo la concentración deseada de anticuerpos conjugados con fluorocromo diluidos en tampón FACS todavía en presencia de la mezcla de bloqueo de Fc. Se utilizaron los siguientes anticuerpos conjugados con fluorocromo: CD45-PerCP-Cyanina5.5 anti-ratón 0,5 µg/ml [ThermoFisher; N.º de gato: 45-0451-82; Clon 30-F11], 0,25 µg/100 µl de CD204(MSR1)-PE anti-ratón [Fisher Scientific; N.º de gato: 12-204-682; Clon M204PA], 0,25 µg/100 µl de CD36-BB515 anti-ratón [BD Biosciences; N.º de gato: 565933; Clon CRF D-2712] y 10 µl/100 µl de MARCO-fluoresceína anti-ratón [Biotechne; N.° de gato: FAB2956F; Clon 579511]. Se incluyeron controles fluorescentes menos uno (FMO) para ayudar a establecer los límites de activación. Se utilizaron controles de isotipo para probar la unión no específica. Se utilizaron los siguientes anticuerpos de control de isotipo: 0,25 µg/100 µl de IgG2a de rata PE, control de isotipo κ [Fisher Scientific; N.º de gato: 15248769; Clon eBR2a], 0,25 µg/100 µl de IgA de ratón BB515, control de isotipo κ [BD Biosciences; N.º de gato: 565095; Clon M18-254] y 10 µl/100 µl de control de isotipo de fluoresceína de IgG1 de rata [Biotechne; N.º de catálogo: IC005F; Clon IC0057]. Finalmente, se utilizaron muestras teñidas con un solo fluoróforo como controles de compensación. Después de la tinción, las muestras se resuspendieron en tampón FACS para tinciones únicas y controles sin teñir y en tampón FACS con 0,2 μg/ml de DAPI [ThermoFisher], una tinción de muertos vivos, para todas las demás muestras.

Las muestras teñidas se procesaron en el citómetro de flujo Attune NxT [ThermoFisher] y se adquirieron utilizando el software Attune NxT [ThermoFisher]. Los datos resultantes se analizaron utilizando el software FlowJo v10.8.1 para MacOS [BD Life Sciences]. Antes de determinar la proporción de macrófagos positivos para un fluorocromo particular, se empleó una estrategia de activación para lograr la exclusión secuencial de desechos y dobletes (Figura complementaria 6). Se usó Anti-CD45-PerCP-Cyanine5.5 para identificar los leucocitos totales y DAPI para excluir las células muertas.

Se utilizó GraphPad Prism versión 9.5.0 para MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA) para generar representaciones gráficas de datos numéricos. Se realizaron pruebas estadísticas inferenciales utilizando Prism. Se supuso que los conjuntos de datos estaban distribuidos normalmente según los resultados de una prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. En consecuencia, para comparar las medias entre tratamientos, se realizaron las siguientes pruebas paramétricas: prueba t bilateral no pareada, ANOVA unidireccional y ANOVA bidireccional. Las pruebas ANOVA fueron seguidas por la prueba post-hoc de Tukey. La variación entre tratamientos se consideró estadísticamente significativa si el valor de p <0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos originales se proporcionan con este documento.

May, RC, Stone, NRH, Wiesner, DL, Bicanic, T. & Nielsen, K. Cryptococcus: de saprófito ambiental a patógeno global. Nat. Rev. Microbiol 14, 106-117 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Maziarz, EK y Perfect, JR Criptococosis. Infectar. Dis. Clínico. Norte Am. 30, 179–206 (2016).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Rajasingham, R. y col. Carga global de morbilidad por meningitis criptocócica asociada al VIH: un análisis actualizado. Infección por lanceta. Dis. 17, 873–881 (2017).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Osterholzer, JJ y cols. Papel de las células dendríticas y los macrófagos alveolares en la regulación de la defensa temprana del huésped contra la infección pulmonar por Cryptococcus neoformans. Infectar. Inmune. 77, 3749–3758 (2009).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Lim, J. y col. Caracterizar los mecanismos de captación no opsónica de criptococos por macrófagos. J. Inmunol. 200, 3539–3546 (2018).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Mitchell, TG & Perfect, JR Criptococosis en la era del SIDA: 100 años después del descubrimiento de Cryptococcus neoformans. Clínico. Microbiol Rev. 8, 515–548 (1995).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Shao, X. y col. Una célula del sistema inmunológico innato es un determinante importante de las diferencias de susceptibilidad entre especies a la neumonía fúngica. J. Inmunol. 175, 3244–3251 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Campuzano, A. & Wormley, F. Inmunidad innata contra criptococos, desde el reconocimiento hasta la eliminación. JoF 4, 33 (2018).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Shoham, S., Huang, C., Chen, J.-M., Golenbock, DT y Levitz, SM El receptor tipo Toll 4 media la señalización intracelular sin liberación de tnf-α en respuesta a la cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans. J. Inmunol. 166, 4620–4626 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, K. y col. Los ácidos desoxinucleicos de Cryptococcus neoformans activan las células dendríticas mieloides a través de una vía dependiente de tlr9. J. Inmunol. 180, 4067–4074 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brown, GD & Gordon, S. Un nuevo receptor de β-glucanos. Naturaleza 413, 36–37 (2001).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Tada, H. y col. El manano derivado de Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans indujo la producción de factor de necrosis tumoral alfa por parte de monocitos humanos de una manera dependiente de cd14 y del receptor tipo peaje 4. Microbiol. Inmunol. 46, 503–512 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Qiu, Y. et al. El receptor carroñero a modula la respuesta inmune a la infección pulmonar por Cryptococcus neoformans. J. Inmunol. 191, 238–248 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Significa, TK et al. Reconocimiento evolutivamente conservado e inmunidad innata a patógenos fúngicos por parte de los receptores carroñeros SCARF1 y CD36. J. Exp. Medicina 206, 637–653 (2009).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Xu, J. y col. El receptor eliminador MARCO organiza las defensas tempranas y contribuye a la contención de hongos durante la infección criptocócica. J. Inmunol. 198, 3548–3557 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gantner, BN, Simmons, RM y Underhill, DM Dectin-1 media el reconocimiento de macrófagos de la levadura Candida albicans pero no de los filamentos. EMBO J. 24, 1277–1286 (2005).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Taylor, PR y cols. Dectin-1 es necesaria para el reconocimiento de β-glucano y el control de la infección por hongos. Nat. Inmunol. 8, 31–38 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Garelnabi, M. & May, RC Variabilidad en las respuestas inmunes innatas del huésped a la criptococosis. Memoria. Inst. Oswaldo Cruz 113, e180060 (2018).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Leopold Wager, CM, Hole, CR, Wozniak, KL & Wormley, FLJ Criptococos y fagocitos: interacciones complejas que influyen en el resultado de la enfermedad. Frente. Microbiol. 7, 105 (2016).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Kawai, T. y Akira, S. El papel de los receptores de reconocimiento de patrones en la inmunidad innata: actualización sobre los receptores tipo Toll. Nat. Inmunol. 11, 373–384 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vidya, MK y cols. Receptores tipo peaje: importancia, ligandos, vías de señalización y funciones en mamíferos. En t. Rev. Immunol. 37, 20-36 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Freeman, SA y Grinstein, S. Fagocitosis: receptores, integración de señales y citoesqueleto. Inmunol. Rev. 262, 193–215 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Voelz, K., Lammas, DA y May, RC La señalización de citoquinas regula el resultado del parasitismo intracelular de macrófagos por Cryptococcus neoformans. Infectar. Inmune. 77, 3450–3457 (2009).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Goldstein, JL, Ho, YK, Basu, SK y Brown, MS Sitio de unión en macrófagos que media la absorción y degradación de lipoproteínas acetiladas de baja densidad, produciendo una deposición masiva de colesterol. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 76, 333–337 (1979).

Artículo ADS CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Abdul Zani, I. et al. Estructura y función del receptor carroñero en la salud y la enfermedad. Celdas 4, 178–201 (2015).

Artículo CAS PubMed Central Google Scholar

Canton, J., Neculai, D. y Grinstein, S. Receptores carroñeros en la homeostasis y la inmunidad. Nat. Rev. Immunol. 13, 621–634 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Murshid, A., Borges, TJ, Lang, BJ y Calderwood, SK El receptor carroñero srec-i coopera con receptores tipo peaje para desencadenar respuestas inmunes inflamatorias innatas. Inmunol frontal. 7, 226 (2016).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Meng, J., Gong, M., Björkbacka, H. y Golenbock, DT Los estudios de mutagénesis y perfiles de expresión genómica amplia revelan que la capacidad de respuesta del LPS parece ser absolutamente dependiente de la expresión de TLR4 y MD-2 y depende de las interacciones iónicas intermoleculares. J. Inmunol. 187, 3683–3693 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Doyle, SE y cols. Los receptores tipo peaje inducen un programa de genes fagocíticos a través de p38. J. Exp. Medicina 199, 81–90 (2004).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Fejer, G. et al. Las líneas de macrófagos dependientes de GM-CSF no transformadas son un modelo único para estudiar las funciones de los macrófagos tisulares. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 110, E2191–E2198 (2013).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Bagchi, A. et al. Vías dependientes de MyD88 e independientes de myd88 en sinergia, preparación y tolerancia entre agonistas de TLR. J. Inmunol. 178, 1164-1171 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, K. y col. Contribución limitada de los receptores tipo Toll 2 y 4 a la respuesta del huésped a un patógeno infeccioso fúngico, Cryptococcus neoformans. Inmunol FEMS. Med Microbiol 47, 148-154 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Biondo, C. y col. MyD88 y TLR2, pero no TLR4, son necesarios para la defensa del huésped contra Cryptococcus neoformans. EUR. J. Inmunol. 35, 870–878 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, JP, Lee, CK, Akalin, A., Finberg, RW y Levitz, SM Contribuciones de los receptores dependientes de MyD88 IL-18R, IL-1R y TLR9 a las defensas del huésped después de la provocación pulmonar con Cryptococcus neoformans. MÁS UNO 6, e26232 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Amiel, E. et al. Avance fundamental: regulación del receptor tipo peaje de la fagocitosis mediada por el receptor A del carroñero. J. Leukoc. Biol. 85, 595–605 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu, T., Zhang, L., Joo, D. y Sun, S.-C. Señalización de NF-κB en la inflamación. Transducto Sig. Apunta allí. 2, 1–9 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Tsukamoto, H. y col. La proteína de unión a lipopolisacárido (LPS) estimula la internalización del receptor tipo Toll 4 dependiente de CD14 y la activación del eje TBK1-IKKϵ-IRF3 inducida por LPS. J. Biol. Química. 293, 10186–10201 (2018).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Gratacap, RL, Rawls, JF y Wheeler, RT La candidiasis mucosa provoca activación de NF-κB, expresión de genes proinflamatorios y neutrofilia localizada en el pez cebra. Dis. Modelos de mecanismos 6, 1260-1270 (2013).

CAS Google Académico

Heit, B. et al. Los complejos de señalización multimolecular permiten la señalización mediada por syk de la internalización de cd36. Célula de desarrollo 24, 372–383 (2013).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ La tirosina quinasa SYK: un actor crucial en diversas funciones biológicas. Nat. Rev. Immunol. 10, 387–402 (2010).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Vanhaesebroeck, B., Stephens, L. y Hawkins, P. Señalización PI3K: el camino hacia el descubrimiento y la comprensión. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 13, 195-203 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Miller, YI, Choi, S.-H., Wiesner, P. & Bae, YS El lado SYK de TLR4: mecanismos de señalización en respuesta a LPS y LDL mínimamente oxidada. Hno. J. Farmacéutica. 167, 990–999 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Gay, Nueva Jersey, Symmons, MF, Gangloff, M. y Bryant, CE Ensamblaje y localización de complejos de señalización del receptor tipo Toll. Nat. Rev. Immunol. 14, 546–558 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, K. y col. Dectin-1 no es necesario para la defensa del huésped contra Cryptococcus neoformans. Microbiol. Inmunol. 51, 1115-1119 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mukhopadhyay, S. et al. La administración de ligando mediada por SR-A/MARCO mejora la función intracelular de TLR y NLR, pero la eliminación del ligando de la superficie celular limita la respuesta de TLR4 a los patógenos. Sangre 117, 1319-1328 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

El Consorcio UniProt. UniProt: la base de conocimiento universal sobre proteínas en 2023. Nucleic Acids Res. 51, D523–D531 (2023).

Artículo de Google Scholar

Todt, JC, Hu, B. y Curtis, JL El receptor eliminador SR-A I/II (CD204) envía señales a través del receptor tirosina quinasa Mertk durante la captación de células apoptóticas por parte de macrófagos murinos. J. Leukoc. Biol. 84, 510–518 (2008).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Miki, S. y col. Asociación funcional y posible física del receptor carroñero con la tirosina quinasa citoplasmática Lyn en macrófagos monocíticos derivados de THP-1. FEBS Lett. 399, 241–244 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hashimoto, R. y col. El LPS mejora la expresión de CD204 a través de la vía MAPK/ERK en macrófagos de la médula ósea murina. Aterosclerosis 266, 167-175 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hashimoto, R. y col. Regulación dependiente de JAK-STAT de receptores carroñeros en macrófagos murinos activados por LPS. EUR. J. Farmacol. 871, 172940 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yauch, LE, Mansour, MK, Shoham, S., Rottman, JB & Levitz, SM Participación de CD14, receptores tipo Toll 2 y 4 y MyD88 en la respuesta del huésped al patógeno fúngico Cryptococcus neoformans in vivo. Infectar. Inmune. 72, 5373–5382 (2004).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Yauch, LE, Mansour, MK y Levitz, SM Aclaramiento mediado por receptores del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans in vivo. Infectar. Inmune. 73, 8429–8432 (2005).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Redlich, S., Ribes, S., Schütze, S., Eiffert, H. y Nau, R. La estimulación del receptor tipo peaje aumenta la fagocitosis de Cryptococcus neoformans por parte de las células microgliales. J. Neuroinflamación 10, 841 (2013).

Artículo de Google Scholar

Hansakon, A., Jeerawattanawart, S., Pattanapanyasat, K. y Angkasekwinai, P. La señalización del receptor IL-25 modula la defensa del huésped contra la infección por Cryptococcus neoformans. J. Inmunol. 205, 674–685 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Alanio, A., Desnos-Ollivier, M. & Dromer, F. La dinámica de las interacciones entre Cryptococcus neoformans y macrófagos revela que el fondo fúngico influye en el resultado durante la meningoencefalitis criptocócica en humanos. mBio 2, e00158–11 (2011).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Sabiiti, W. y col. La fagocitosis eficiente y la actividad de lacasa afectan el resultado de la criptococosis asociada al VIH. J.Clin. Invertir. 124, 2000-2008 (2014).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Harris, J. y col. La autofagia controla la secreción de IL-1β dirigiéndose a la degradación de Pro-IL-1β. J. Biol. Química. 286, 9587–9597 (2011).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Sakai, J. y col. La translocación nuclear de NF-κB inducida por lipopolisacáridos depende principalmente de MyD88, pero la expresión de TNFα requiere TRIF y MyD88. Ciencia. Rep. 7, 1428 (2017).

Artículo ADS PubMed Central PubMed Google Scholar

Latty, SL et al. La activación de los receptores tipo Toll nuclea el ensamblaje del centro de señalización MyDDosoma. eLife 7, e31377 (2018).

Artículo PubMed Central PubMed Google Scholar

Maler, MD y cols. Papel clave del receptor eliminador MARCO en la mediación de la infección por adenovirus y las respuestas innatas posteriores de los macrófagos. mBio 8, e00670–17 (2017).

PubMed Central PubMed Google Académico

Voelz, K., Johnston, SA, Rutherford, JC y May, RC Análisis automatizado del parasitismo de macrófagos criptocócicos utilizando criptococos etiquetados con GFP. MÁS UNO 5, e15968 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Hageage, G. y Harrington, B. Uso de calcoflúor blanco en micología clínica. https://doi.org/10.1093/LABMED/15.2.109 (1984).

Descargar referencias

Agradecemos a Maria Makarova por su ayuda con la microscopía confocal, a Michael G. Tomlinson por su análisis in-silico de MSR1 y su contribución a la discusión, a Sean D. Kelly por su ayuda técnica con respecto al establecimiento de líneas celulares MPI y a Sarah Dimeloe y Nancy Gudgeon por su ayuda. Asesoramiento sobre la cultura de las PBMC. Las líneas MSR1 knockout y MSR1/MARCO double knockout se establecieron con el apoyo de la subvención NC/V001019/1 de NC3R. El trabajo en el laboratorio CEB cuenta con el apoyo de la subvención BB/V000276/1. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de proyecto de la Royal Society (RGS\R2\202260) para SM lab. CUO cuenta con el respaldo de un Ph.D. beca del Darwin Trust de Edimburgo. ALW contó con el apoyo de Ph.D. financiación del programa de formación doctoral 'MIDAS' de Wellcome Trust. RCM agradece el apoyo del BBSRC y del Premio Consolidador del Consejo Europeo de Investigación.

Instituto de Microbiología e Infecciones y Facultad de Biociencias, Universidad de Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, Reino Unido

Chinaemerem U. Onyishi, Guillaume E. Desanti, Alex L. Wilkinson, Samuel Lara-Reyna, Eva-Maria Frickel y Robin C. May

Facultad de Ciencias Biomédicas, Facultad de Salud, Universidad de Plymouth, Plymouth, Reino Unido

György Fejer

Universidad Paris-Saclay, INSERM, Hemostasia inflamación trombosis HITH U1176, 94276, Le Kremlin-Bicêtre, Francia

Olivier D. Christophe

Universidad de Cambridge, Departamento de Medicina, Box 157, Nivel 5, Addenbrooke's Hospital, Hills Road, Cambridge, CB2 0QQ, Reino Unido

Clara Bryant

Peter Gorer Departamento de Inmunobiología, Facultad de Inmunología y Ciencias Microbianas, King's College London, Londres, SE1 9RT, Reino Unido

Subhankar Mukhopadhyay

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Taoyuan, Taiwán

Sonon Gordon

Escuela de Patología Sir William Dunn, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Sonon Gordon

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

RCM concibió el proyecto. ALW y GD generaron datos preliminares que influyeron en la concepción del proyecto. CUO y RCM generaron hipótesis y diseñaron los experimentos. CUO realizó todos los experimentos, analizó los datos y escribió el manuscrito. GD ayudó a realizar los experimentos de citometría de flujo. SLR y EMF aislaron monocitos de conos de leucocitos humanos. CEB proporcionó BMDM inmortalizados Tlr4-/-, MyD88-/-, Trif-/-. SM, SG y GF proporcionaron células Msr1-/-, Marco-/- y DKO MPI. ODC proporcionó líneas celulares transfectadas que contribuyeron a la generación de hipótesis. SM y SG proporcionaron una discusión crítica sobre los resultados experimentales. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito. RCM adquirió financiación.

Correspondencia a Robin C. May.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Julianne Djordjevic y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Onyishi, CU, Desanti, GE, Wilkinson, AL et al. La interferencia del receptor tipo peaje 4 y del receptor 1 eliminador de macrófagos regula la fagocitosis de un patógeno fúngico. Nat Comuna 14, 4895 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40635-w

Descargar cita

Recibido: 27 de enero de 2023

Aceptado: 03 de agosto de 2023

Publicado: 14 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40635-w

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.