Un glicolípido inmunoestimulante que bloquea el SARS

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3959 (2023) Citar este artículo

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Las vacunas profilácticas contra el SARS-CoV-2 han reducido la incidencia de COVID-19 grave, pero la aparición de variantes virales que son antigénicamente distintas de las cepas vacunales es motivo de preocupación y son deseables enfoques preventivos adicionales de acción amplia. Aquí, informamos sobre un glicolípido denominado 7DW8-5 que explota el sistema inmunológico innato del huésped para permitir un control rápido de las infecciones virales in vivo. Este glicolípido se une a CD1d en las células presentadoras de antígenos y, por tanto, estimula a las células NKT para que liberen una cascada de citocinas y quimiocinas. La administración intranasal de 7DW8-5 antes de la exposición al virus bloqueó significativamente la infección por tres variantes auténticas diferentes del SARS-CoV-2, así como por el virus respiratorio sincitial y el virus de la influenza, en ratones o hámsteres. También descubrimos que este efecto antiviral protector está dirigido al huésped y es específico del mecanismo, y requiere tanto la molécula CD1d como el interferón-(gamma). Un compuesto químico como el 7DW8-5, que es fácil de administrar y barato de fabricar, puede ser útil no sólo para frenar la propagación de la COVID-19 sino también para responder a futuras pandemias mucho antes de que se desarrollen vacunas o medicamentos.

Aunque la pandemia de COVID-19 ha devastado a la humanidad durante los últimos tres años, la respuesta científica para desarrollar y desplegar contramedidas contra el agente causal, el SARS-CoV-2, no ha tenido precedentes. En un tiempo récord se incorporaron al arsenal terapéutico los fármacos antivirales1,2 y los anticuerpos monoclonales3,4. Del mismo modo, se desarrollaron muchas vacunas profilácticas para aprovechar el poder de la respuesta inmune adaptativa, y varias de ellas demostraron ser altamente protectoras contra la infección sintomática5,6. Sin embargo, a medida que el SARS-CoV-2 continuó propagándose y las variantes virales continuaron evolucionando, las infecciones causadas por la vacuna se han convertido en un fenómeno común, particularmente después de la aparición de las subvariantes Omicron, que son antigénicamente las más distintas de las cepas ancestrales7,8. Nuevas estrategias de prevención podrían ayudar a frenar la transmisión de este patógeno viral en todo el mundo, incluidos enfoques que aprovechen el sistema inmunológico innato del huésped y permitan un control rápido de la infección. Por ejemplo, se demostró que los ratones tratados antes o poco después de la infección con una combinación de agonistas inhalados de los receptores tipo Toll (TLR) 2/6 y 9 (Pam2-ODN) eran ampliamente protectores contra patógenos microbianos, incluidos los virus respiratorios9. Estos agentes inducen la activación de las células presentadoras de antígenos (APC), lo que da como resultado la liberación de citocinas antivirales que median la eliminación del virus. Aquí, evaluamos un agente estimulador de células T asesinas naturales (NKT) para infecciones por virus respiratorios. Las células NKT son un subconjunto de linfocitos que poseen características tanto de células asesinas naturales (NK) como de células T αβ10,11. Estas células forman un elemento clave de la respuesta inmune innata y pueden desempeñar un papel no solo en el cáncer12,13,14 y las enfermedades autoinmunes15, sino también en la protección contra infecciones16,17,18,19. Algunas células NKT poseen un receptor de células T semiinvariante (iTCR) y, por lo tanto, se denominan células NKT invariantes (células iNKT), que reconocen ciertos glicolípidos unidos a moléculas CD1d en células presentadoras de antígenos (p. ej., células dendríticas o CD)20 y Células B21, desencadenando así una cascada de citocinas y quimiocinas10,11 (Fig. 1a). Se han realizado varios estudios que muestran la importancia de las células iNKT contra infecciones virales, como CMV, infección retroviral, RSV e influenza22,23,24,25,26, así como el papel de las células NKT en el contexto de la lucha contra la adaptación. -respuesta inmune viral27,28,29,30. El primer ligando CD1d identificado fue un glicolípido denominado α-galactosilceramida (α-GalCer)31. Desde entonces, se han descrito más de una docena de análogos de α-GalCer hasta la fecha14,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, todos los cuales son capaces de estimular Células iNKT en el contexto de moléculas CD1d, lo que resulta en el ejercicio de actividades contra diversas infecciones, cánceres y enfermedades autoinmunes principalmente en un modelo de ratón. A partir de una biblioteca enfocada de glicolípidos sintéticos, hemos descubierto un análogo de α-GalCer, 7DW8-5 (Fig. 1a), que también estimula las células iNKT en el contexto de CD1d, pero exhibe una actividad inmunoestimuladora aún más potente en iNKT tanto de ratón como de humano. células in vitro44. Tras la estimulación, las células iNKT no solo secretan citoquinas Th1 que tienen efectos antivirales conocidos24,25,45, sino que también activan poblaciones de células NK y células T CD8+14,46,47. Cada una de estas poblaciones de células activadas podría liberar múltiples citocinas, incluido el interferón-γ (IFN-γ), que tiene efectos protectores conocidos contra varias infecciones virales30,48,49.

Un esquema que muestra la interacción entre las células iNKT que portan iTCR y las células dendríticas (DC) que portan CD1d que está unido al glicolípido 7DW8-5 creado con BioRender. Protección sólida contra la infección, manifestada por el mantenimiento del peso corporal y la reducción de la carga viral (según lo determinado por cultivos de dilución de punto final) en los tejidos pulmonares el día 3 después de la exposición al virus (d3) IN (intranasal), conferida por 7DW8-5 administrado en (b) 2 µg IV (intravenoso) o IN 2 días antes de la exposición [d(-2)]. c Protección contra la infección conferida por 7DW8-5 administrado a 2 µg IN 1 o 2 días antes de la exposición al virus [d(-1) o d(-2)] y menos potente si se administra 3 días antes de la exposición [d(-3)] , pero no cuando se administra 2 h después del desafío [h(+2)]. (d) 0,5 o 2 µg IN pero menos a 0,1 µg. e La repetición de la dosis de 7DW8-5 (0,2 µg; IN) cada dos días durante 10 días (5x) confirió una protección comparable a una dosis única 2 días antes de la exposición viral (1x). f Protección contra la infección conferida por 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 días antes de la exposición) detectada tanto en los pulmones como en los cornetes nasales. Las líneas de puntos en los gráficos TCID50/g indican el límite de cuantificación de la carga viral. Se realizó un análisis estadístico no paramétrico para los experimentos que se muestran en (b) a (f), en Prism v 9.3 utilizando la prueba U de Mann-Whitney de dos colas, y los resultados (incluidas las estadísticas) representan uno de dos experimentos biológicos independientes. La media (línea negra) ± SEM se representa para cada uno de los gráficos anteriores (b – f). g Imágenes representativas de 100 X de pulmones de ratones tratados con 7DW8-5 y solución salina antes y después de la infección por SARS-CoV-2 MA10. H&E se muestra en los paneles superiores. Los paneles inferiores muestran el etiquetado de inmunohistoquímica (IHC) contra la nucleocápside del SARS-CoV-2, contrateñido con hematoxilina.

En este trabajo, mostramos que el efecto dependiente de las células CD1d-iNKT de 7DW8-544,50 previene la infección por SARS-CoV-2, el virus respiratorio sincitial (VRS) y el virus de la influenza en modelos animales.

Probamos la hipótesis de que el efecto inmunoestimulador de 7DW8-5 podría inhibir la infección por SARS-CoV-2 en ratones. Primero, se administró 7DW8-5 (2 microgramos (μg)) por vía intravenosa (IV) o intranasal (IN) a grupos de ratones BALB/c dos días antes de que cada animal fuera expuesto IN con 5 x 104 unidades formadoras de placas (UFP) de la cepa MA1051 adaptada al ratón del SARS-CoV-2. Un tercer grupo de ratones recibió solución salina y sirvió como control, mientras que un cuarto grupo recibió 7DW8-5 (2 µg; IN) 2 h después de la exposición al virus. En comparación con los controles, las administraciones previas a la exposición intravenosa e intravenosa de 7DW8-5 dieron como resultado una protección significativa contra la infección por MA10, como se manifiesta por la preservación del peso corporal y reducciones sorprendentes del virus infeccioso en los tejidos pulmonares (Fig. 1b). Se realizó un estudio de seguimiento para evaluar el momento del efecto antiviral ejercido por 7DW8-5 (2 µg; IN). Se observó una fuerte protección contra la infección por MA10 cuando se administró este glicolípido a ratones uno o dos días antes de la exposición al virus, mientras que la protección fue solo parcial cuando se administró tres días antes (Fig. 1c). La administración posterior a la exposición de 7DW8-5 mostró un efecto protector parcial (Fig. 1c). Luego, un experimento de exploración de dosis demostró una protección sólida de 7DW8-5 (IN; 2 días antes) en dosis de 0,5 µg o 2 µg, mientras que la protección fue subóptima con una dosis de 0,1 µg (Fig. 1d).

A continuación, evaluamos si la dosificación repetida de 7DW8-5 podría provocar una posible anergia de las células NKT y, por tanto, la pérdida de su eficacia antiviral. Con este fin, se administró 7DW8-5 (0,2 µg; IN) a un grupo de ratones en días alternos durante 10 días (para un total de cinco dosis) antes de la exposición a MA10. Como comparador, otro grupo de ratones recibió el mismo glicolípido (0,2 µg; IN) solo una vez dos días antes de la exposición al virus. Los efectos protectores observados fueron equivalentes para los dos grupos (Fig. 1e), lo que indica falta de anergia con la dosis repetida de 7DW8-5 en estas condiciones experimentales. Se ha demostrado que una administración intraperitoneal o intravenosa de una dosis grande (2-5 µg) de un glicolípido estimulador de iNKT (α-GalCer) indujo anergia de las células iNKT que causa falta de respuesta en ratones52,53. Por lo tanto, también probamos una dosis mayor (2 µg) de glicolípido 7DW8-5 por vía intranasal en ratones en días alternos durante 10 días antes de la exposición a MA10 (Figura 1 complementaria). Aunque el grado de actividad antiviral se redujo, la administración repetida de una dosis grande del glicolípido aún podría ejercer efectos protectores. Este hallazgo fue corroborado por un estudio anterior que muestra que la administración intranasal, pero no intravenosa, de α-GalCer permite la estimulación repetida de las células T asesinas naturales en el pulmón54. Finalmente, para evaluar si el efecto antiviral se produjo en el sitio de la inoculación del virus, a los ratones se les administró nuevamente 7DW8-5 (2 µg; IN) dos días antes de la exposición a MA10, seguido de la recolección de cornetes nasales y pulmones tres días después. Se observaron reducciones marcadas de la infección por SARS-CoV-2 en ambos conjuntos de tejidos de ratones tratados con 7DW8-5 (Fig. 1f).

Los análisis histopatológicos pulmonares con tinción con hematoxilina y eosina (H y E) antes y después del desafío MA10 revelaron daño multifocal temprano con una acumulación de células inflamatorias, células epiteliales descamadas y proteínas plasmáticas en la luz de las vías respiratorias (Fig. 1g). El tratamiento con 7DW8-5 evitó dicho daño al tejido pulmonar. La tinción por inmunohistoquímica (IHC)51,55 para la nucleocápside del SARS-CoV-2 reveló una tinción intensa 3 días después de la infección en el tejido pulmonar de un ratón tratado con solución salina y desafiado con MA10, mientras que hubo una tinción reducida y ninguna tinción visible en los tejidos pulmonares de ratones tratados con una dosis única o dosis repetidas de 7DW8-5, respectivamente (Fig. 1g). De hecho, cuando se contó el número de puntos infectados, tanto la dosis única como la múltiple de 7DW8-5 redujeron significativamente el número de puntos (Figura 2 complementaria), lo que coincide con la reducción observada en los títulos virales pulmonares (Figura 1b-e). .

También evaluamos el efecto antiviral de 7DW8-5 contra otras cepas de SARS-CoV-2, comenzando con las subvariantes BA.1 y BA.5 de Omicron, que pueden infectar ratones de tipo salvaje sin adaptación previa. Sin embargo, este modelo de infección normalmente no produjo pérdida de peso en los animales infectados, así como niveles más bajos de replicación del virus56. En comparación con los controles, la administración de 7DW8-5 (2 µg; IN) 2 días antes de la exposición al virus (1,5 × 105 UFP) produjo un aumento de peso significativo y una inhibición completa o robusta de la replicación del virus en los tejidos pulmonares (Fig. 2a, b). . Se llevó a cabo un experimento similar utilizando la variante Delta, que no puede infectar a ratones de tipo salvaje, pero puede infectar a ratones transgénicos ACE2 humanos K18, así como a hámsteres57. Una vez más, la administración de 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 días antes) redujo significativamente la carga viral en los tejidos pulmonar y nasal de los ratones transgénicos K18 humano-ACE2 desafiados por el virus (103 PFU) (Fig. 2c). De manera similar, 7DW8-5 (100 µg/kg; IN) administrado 2 días antes del desafío con la variante Delta (105 UFP) disminuyó significativamente la carga viral en los tejidos pulmonares y nasales de los hámsteres tratados (Fig. 2d). En ambos experimentos, la protección contra la variante Delta fue menos sólida que la observada previamente para las subvariantes MA10 u Omicron en ratones de tipo salvaje, quizás debido a diferencias en la susceptibilidad al virus de los modelos animales. Por ejemplo, se sabe que el patrón de expresión de hACE2 es diferente en ratones K18-hACE2 Tg58, lo que probablemente los hace más permisivos a la infección.

La amplitud de la protección conferida por 7DW8-5 (IN; 2 días antes) se extiende a las variantes Omicron BA.1 y BA.5 del SARS-CoV-2 en ratones BALB/c (a, b) y a la variante Delta en el transgénico K18 humano-ACE2 Ratones C57BL/6 (c) o hámsteres sirios (d), así como a la cepa RSV A2 en ratones BALB/c (e) y a la cepa influenza A1/H1N1/PR8 en ratones C57BL/6 (f, g). La dosis de virus de desafío utilizada se indica en la parte superior de cada panel de figuras, y la cantidad de animales utilizados se refleja en la cantidad de puntos de datos. La dosis de 7DW8-5 administrada a los ratones fue de 2 µg cada uno, mientras que la dosis para los hámsteres fue de 100 µg/kg. En (a, b), el peso corporal se midió antes y el día 3 después de la exposición viral, y la carga viral infecciosa se determinó 3 días después de la exposición viral, como se hizo en (c) para los tejidos pulmonar y nasal. En (d), la carga viral se determinó 5 días después de la exposición. En (e), el peso corporal se midió antes y el día 2 después de la exposición viral, y la carga viral pulmonar se determinó 4 días después de la exposición. En (f), el peso corporal se midió antes y el día 3 después de la exposición, y la carga viral pulmonar se determinó 3 días después de la exposición. En (g), se muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier después de una exposición letal al virus de la influenza. Se realizó un análisis estadístico no paramétrico para todos los experimentos mostrados en (a) a (f), en Prism v 9.3, utilizando la prueba U de Mann-Whitney de dos colas, y los resultados (incluidas las estadísticas) representan uno de dos experimentos biológicos independientes. . La media (línea negra) ± SEM se representa para cada uno de los gráficos anteriores (a – f). Las líneas de puntos en los gráficos TCID50/g y PFU/mL indican el límite de cuantificación de la carga viral. Se realizó una prueba de Cox-Mantel de rango logarítmico en (g) para comparar las curvas de supervivencia de los dos grupos con un índice de riesgo de 10,63 entre ellos.

Dado que 7DW8-5 no tenía actividad antiviral directa contra el SARS-CoV-2 in vitro (Figura complementaria 3) y probablemente estimulaba una parte del sistema inmunológico innato, luego exploramos si su protección podría extenderse a otros virus clínicamente importantes. patógenos: RSV y virus de la influenza. Para el primero, se utilizó una cepa RSV-A2 que se sabe que infecta a ratones BALB/c59. Como se muestra en la Fig. 2e, la administración de 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 días antes) previno significativamente la pérdida de peso e inhibió la infección viral en los tejidos pulmonares de los ratones tratados. Para los estudios de influenza, se utilizó la cepa A/H1N1/PR8 que se sabe que infecta a ratones C57BL/660. Nuevamente, la administración de 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 días antes) previno significativamente la pérdida de peso corporal y redujo la cantidad de virus infeccioso en los tejidos pulmonares de los ratones tratados (Fig. 2f). En un experimento a largo plazo utilizando una dosis letal (5 × 103 PFU) de influenza A/H1N1/PR8, todos los ratones de control murieron el día 10 después de la exposición al virus como se esperaba, mientras que 8 de 10 ratones que recibieron 7DW8-5 sobrevivieron (Fig. 2g). En conjunto, los hallazgos de la Fig. 2 sugieren que este glicolípido tiene una actividad protectora sustancial contra virus respiratorios divergentes, tal vez debido a la estimulación de una vía inmune específica, seguida de una estimulación recíproca de las células iNKT y la activación de las DC que expresan CD1d.

Posteriormente determinamos el nivel de expresión genética de citocinas/quimiocinas en el tejido de los cornetes nasales de ratones BALB/c un día después de la administración de 7DW8-5 (2 µg; IN) o solución salina. Promediamos tres experimentos independientes, cada uno de los cuales constaba de 3 ratones BALB/c. IFN-γ fue la citocina con mayor regulación positiva en el cornete nasal tras el tratamiento con 7DW8-5 (Fig. 3a). También caracterizamos el perfil de citocinas/quimiocinas en lavado broncoalveolar (BAL), homogeneizados de cornetes nasales o pulmones y sueros en ratones BALB/c (N = 6) un día después de la administración de 7DW8-5 (2 µg; IN) o solución salina. . Se detectó una marcada regulación positiva de múltiples citocinas/quimiocinas en todos los compartimentos examinados de los animales tratados, incluidos IFN-γ, IL-5, IL-6, IP-10, TNF-α, MCP1 y MIG (Fig. 3b). El IFN-γ, en particular, es una citocina antiviral conocida61. Dado que también se ha informado que IFN-λ tiene actividad contra el SARS-CoV-2 en ratones62, también medimos los niveles de esta citocina en los sobrenadantes de homogeneizados de cornetes nasales y pulmones, así como en sueros, de ratones tratados con 7DW8- 5 (2 µg; IN; 1 día antes) o solución salina. No se observó evidencia de inducción de IFN-λ (Figura complementaria 4). Se realizó un análisis de secuencia de ARN unicelular de células mononucleares de pulmón de ratones tratados con 7DW8-5 de acuerdo con un protocolo experimental específico (Figuras complementarias 5a, b), y los niveles de expresión de genes marcadores representativos se documentaron dentro de 18 distintos. poblaciones de células inmunes (Figura complementaria 5c). La observación más destacada es el cambio aparente hacia la producción de IFN-γ que se observa en las células NK y las células T en proliferación, así como en las células iNKT y las células T γδ, después de la exposición a 7DW8-5 (Fig. 3c). Estos hallazgos implican que el IFN-γ posiblemente tenga un papel central en la mediación de la actividad antiviral de nuestro glicolípido. El análisis adicional de las células iNKT identificadas en cada UMAP de 7DW8-5 y solución salina (Fig. 3c) las categorizó aún más en subconjuntos de iNKT que incluyen iNKT1, iNKT2, iNKT17 e iNKT10, según la expresión de los marcadores genéticos característicos, como se describió anteriormente63. La mayoría del subconjunto de células iNKT, que se había expandido entre las multinacionales pulmonares 3 días después de la administración intranasal (2 µg) de 7DW8-5, era iNKT1 (Figura complementaria 6a). Por lo tanto, un subconjunto de iNKT1, que secreta IFN-γ, parece contribuir predominantemente a la eliminación viral. A partir de nuestros datos de UMAP (Fig. 3c), también categorizamos los subconjuntos de DC y determinamos que se encontró que el 30% de las DC maduras (mDC) expresaban IL-15 entre las multinacionales pulmonares 3 días después de la administración intranasal (2 µg) de 7DW8-5. Fig. complementaria 6b), mientras que las mDC expresan constitutivamente IL-12 (datos no mostrados). Las CD plasmocitoides (pDC) y las CD convencionales (cDC) expresan una cantidad mínima de IL-12 (datos no mostrados) antes y después del tratamiento con 7DW8-5.

un mapa de calor que muestra la expresión diferencial de los genes (como se indica) en los cornetes nasales (NT), que es un promedio de tres experimentos independientes, cada uno de los cuales consta de un grupo de 3 ratones BALB/c 24 h después de 7DW8-5 (2 µg) o administración de solución salina por IN. La barra de escala muestra la puntuación Z promedio. b Inducción de citocinas/quimiocinas en lavado broncoalveolar (BAL), sobrenadantes de homogeneizados de pulmón (LH) y cornetes nasales (NT) y sueros 24 h después de la administración de 7DW8-5 a ratones (N = 6), según lo evaluado con el ratón Plataforma Cytokine Array/Chemokine Array 31-Plex (MD31) (Eve Technologies). Las concentraciones de citoquinas se representan (en círculos) y se muestran los promedios (usando gráficos de barras), y el cambio observado con el tratamiento con 7DW8-5 se expresa en la parte superior. c Cambio hacia células productoras de IFN-\(\gamma\) según lo presentado por la aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) de un total de 27.532 células CD45+ individuales de los pulmones de 3 ratones BALB/c 24 h después del tratamiento con 7DW8-5 o solución salina (Consulte también la figura complementaria 5a). La UMAP se dividió en 15.397 células individuales (7DW8-5, izquierda) y 12.135 células individuales (solución salina, derecha). Cada grupo (como se indica) se identificó mediante agrupamiento no supervisado y se coloreó por separado. Las células iNKT se identificaron en función de la expresión del TCR semiinvariante Vα14-Jα18.

La parte final de este estudio abordó el mecanismo de protección para 7DW8-5. Primero, se examinó el papel de la activación mediada por CD1d comparando 7DW8-5 con su compuesto parental activo, α-GalCer, y con caproilamina PE 1:18, que se sabe que se une a CD1d sin estimular las células iNKT debido a la falta de un resto de azúcar (Figura complementaria 7)44,64. Tanto la administración de 7DW8-5 como la de α-GalCer (0,1 µg; IN; 2 días antes) dieron como resultado protección. Sin embargo, existe una diferencia significativa en la carga viral pulmonar entre los ratones que recibieron α-GalCer versus 7DW8-5 tras la exposición a MA10 (Fig. 4a). La administración de caproilamina PE 1:18 en una dosis mucho más alta (2 µg; IN) no logró proteger. Este hallazgo condujo a un experimento posterior con ratones knock-out (KO) para CD1d. De hecho, el efecto protector de 7DW8-5 observado en ratones de tipo salvaje contra el desafío MA10 del SARS-CoV-2 fue completamente abolido en ratones CD1d-KO (Fig. 4b), lo que demuestra el papel indispensable de la activación de CD1d en la actividad antiviral de 7DW8. -5.

a 7DW8-5 (0,1 µg; IN) y α-GalCer (0,1 µg; IN) ejercen en menor grado un efecto protector contra el SARS-CoV-2 en ratones BALB/c cuando se administran 2 días antes de la exposición intranasal con 50 000 UFP del Cepa MA10. La protección se basó en los cambios de peso corporal y la carga viral infecciosa en los tejidos pulmonares el día 3 después de la exposición al virus. El efecto protector de 7DW8-5 se suprime en ratones CD1d-KO BALB/c (b) o ratones IFN-\(\gamma\)-KO C57BL/6 (c). d El efecto protector de 7DW8-5 observado en ratones de tipo salvaje se pierde con el pretratamiento con un anticuerpo monoclonal bloqueador anti-IFN-\(\gamma\) de ratón (XMG 1.2 a 0,5 mg), pero se conserva con pretratamiento intraperitoneal. tratamiento con un anticuerpo monoclonal de control de isotipo IgG1 de ratón (0,5 mg). Se dosificaron 2 µg de 7DW8-5 en cada animal utilizado en (b – d). Se realizó un análisis estadístico no paramétrico para todos los experimentos mostrados en (a) a (d), en Prism v 9.3 utilizando la prueba U de Mann-Whitney de dos colas, y los resultados (incluidas las estadísticas) representan uno de los dos experimentos biológicos independientes. La media (línea negra) ± SEM se representa para cada uno de los gráficos anteriores. Las líneas de puntos en los gráficos TCID50/g indican el límite de cuantificación de la carga viral.

A continuación, determinamos el papel que desempeñaba el IFN-γ al contribuir a la actividad biológica de 7DW8-5 mediante la realización de estudios de protección en ratones deficientes en IFN-γ. Una vez más, la actividad antiviral de 7DW8-5 observada en ratones de tipo salvaje contra la exposición a SARS-CoV-2 MA10 se perdió por completo en ratones con IFN-γ-KO (Fig. 4c). Además, el efecto anti-SARS-CoV-2 de 7DW8-5 en ratones de tipo salvaje se eliminó en gran medida mediante la inyección intraperitoneal de un anticuerpo monoclonal bloqueador anti-IFN-γ de ratón antes del tratamiento con glicolípidos (Fig. 4d). Estos últimos resultados establecen que el IFN-γ es otro mediador esencial de la actividad de 7DW8-5, junto con CD1d.

La siguiente pregunta inminente se relaciona con la traducibilidad de nuestros hallazgos de modelos de animales pequeños a humanos. Se sabe que la molécula CD1d está altamente conservada entre humanos y ratones20. De hecho, 7DW8-5 pudo estimular notablemente las células NKT CD161highTCRVα24+ humanas primarias para secretar IFN-γ in vitro (Figuras complementarias 8a-c). Lo más importante es que encontramos que los sobrenadantes recolectados de líneas celulares iNKT humanas estimuladas con células Hela transfectadas con CD1d en presencia de 7DW8-5, pero no de PE, pudieron inhibir significativamente la infección por ic-SARS-CoV-2-mNeonGreen65 en Huh7. células in vitro66, y que esta inhibición se eliminó por completo cuando se agregó al cultivo neutralizante IFN-γ Ab antihumano (Figura complementaria 8d). Todos estos resultados indican un papel importante que desempeña el IFN-γ en la mediación de la actividad anti-SARS-CoV-2 por 7DW8-5 tanto en ratones como en humanos.

Hemos descubierto que la administración intranasal de 7DW8-5, un glicolípido inmunoestimulador, funcionó bien como profilaxis previa a la exposición para bloquear la infección por SARS-CoV-2 en ratones de tipo salvaje, como lo demuestra el mantenimiento del peso corporal y una reducción >2 log del virus. replicación en el pulmón (Fig. 1b-f), así como por la marcada reducción de la proteína de la nucleocápside viral en el tejido pulmonar (Fig. 1g). La carga viral en los cornetes nasales también se redujo ~50 veces (Fig. 1f), lo que es más que el bloqueo observado con anticuerpos monoclonales en este compartimento tisular67. Sin embargo, la administración posterior a la exposición de 7DW8-5 fue ineficaz (Fig. 1c), lo que sugiere que este glicolípido no será útil como terapéutico, tal vez porque sus efectos inmunoestimuladores necesitan una ventaja suficiente para frenar un virus de rápida replicación. También demostramos que la protección conferida por 7DW8-5 se extendía a tres variantes auténticas del SARS-CoV-2, incluidas las subvariantes Omicron BA.1 y BA.5 en ratones de tipo salvaje (Fig. 2a, b) y la variante Delta en K18. Ratones y hámsteres transgénicos humanos-ACE2 (Fig. 2c y 2d). Además, se observó una actividad antiviral comparable en ratones después de la exposición al RSV (Fig. 2e) o al virus de la influenza (Fig. 2f, g). En general, estos hallazgos demuestran la amplitud de la protección de 7DW8-5 frente a tres familias de virus respiratorios (coronavirus, paramixovirus y ortomixovirus), cada uno de los cuales no sólo es clínicamente importante sino también con potencial pandémico.

El glicolípido parental, α-GalCer, es un potente activador de las células iNKT, que induce la producción de grandes cantidades de IFN-γ, lo que ayuda a activar tanto las células T CD8+ como las células presentadoras de antígenos (APC), como las CD, los macrófagos y Células B46. Anteriormente hemos demostrado que la acción de 7DW8-5 también depende de las células CD1d e iNKT44. Es de destacar que cuando se administró a ratones una pequeña dosis (0,1 µg) de 7DW8-5 o α-GalCer, seguida de la exposición a MA10, 7DW8-5 ejerció un efecto antiviral significativamente más potente, lo que resultó en una carga de virus pulmonar más reducida. Figura 4a). Si bien este glicolípido indujo muchas citocinas/quimiocinas (Fig. 3a, b), su efecto antiviral fue completamente abolido en ratones CD1d-KO (Fig. 4b), lo cual se anticipó ya que se seleccionó 7DW8-5 para su unión óptima y activación. a través de CD1d tanto humano como de ratón (Fig. 1a) 44. De manera similar, se demostró que otro componente esencial del efecto protector es el IFN-γ, una molécula del sistema inmunológico innato que se sabe que posee amplias actividades antimicrobianas61. De hecho, 7DW8-5 no mostró ninguna protección en ratones IFN-γ-KO (Fig. 4c), y su efecto protector en ratones de tipo salvaje se perdió en gran medida cuando se pretrató con un anticuerpo monoclonal bloqueante anti-IFN-γ. dado (Fig. 4d). Por tanto, tanto CD1d como IFN-γ son necesarios para la actividad de 7DW8-5 in vivo; sin embargo, aún no está claro si ambos son suficientes porque puede haber mediadores importantes aguas abajo del IFN-γ.

Creemos que 7DW8-5 es prometedor como agente para la profilaxis previa a la exposición para prevenir infecciones por SARS-CoV-2, RSV, virus de la influenza y posiblemente otros virus respiratorios clínicamente importantes. Tampoco se nos ha escapado su posible utilidad para futuras pandemias virales. Es un compuesto químico termoestable y, por tanto, sencillo de enviar y almacenar, barato de fabricar y fácil de administrar por vía intranasal. Dadas nuestras experiencias colectivas con la pandemia de COVID-19, no es difícil para cualquiera evocar numerosas situaciones cotidianas en las que se podrían anticipar exposiciones de alto riesgo y en las que se podría aplicar una medida preventiva eficaz, si estuviera disponible. Pero, ¿los resultados de los roedores reportados aquí serían traducibles a los humanos? Una respuesta definitiva sólo podría provenir de la realización de estudios clínicos, pero existe una expectativa razonable de que 7DW8-5 podría ser igualmente eficaz en personas. Primero, seleccionamos este glicolípido de una biblioteca de análogos en función de su potente efecto estimulante sobre las células iNKT humanas in vitro44. 7DW8-5 mostró una afinidad de unión 80 veces mayor a CD1d humano que α-GalCer y ejerció un efecto ahorrador de dosis 140 veces mayor contra células iNKT humanas que α-GalCer. En segundo lugar, las células iNKT constituyen hasta el 1% de las células mononucleares de sangre periférica tanto en humanos como en ratones68,69, aunque la variabilidad es mayor entre humanos68. Por último, hemos demostrado en este estudio que el sobrenadante de células iNKT humanas activadas por 7DW8-5 puede mostrar actividad antiviral in vitro y que la actividad es inhibida por el anticuerpo anti-IFN-γ humano (Figura complementaria 8).

Será necesario superar muchos desafíos antes de que 7DW8-5 pueda considerarse un candidato para el desarrollo clínico. El más importante de ellos es su seguridad y tolerabilidad, porque la inducción de citoquinas, como TNF-α e IL-6 (Fig. 3a, b), podría resultar en una respuesta inflamatoria exagerada. Por lo tanto, serán necesarios estudios formales de seguridad/toxicidad en dos o más especies animales. Sin embargo, varias observaciones abordan esta preocupación. Ensayos clínicos anteriores70,71,72,73 que utilizaron el glicolípido parental, α-GalCer, cuando se administró (6 dosis intravenosas de 0,12 mg/kg) a pacientes con cáncer no mostraron evidencia de toxicidad70. En un estudio de adyuvante de vacuna en macacos rhesus, hasta 100 µg de 7DW8-5 por vía intramuscular no provocaron ninguna reacción adversa74, similar a la falta de toxicidad observada en ratones y hámsteres en el estudio actual. Sin embargo, también serán necesarios estudios adicionales sobre 7DW8-5 para limitar la duración de su efecto profiláctico, determinar con mayor precisión su dosis óptima y evaluar la evidencia de anergia con su uso repetido durante un período prolongado.

Las vacunas actuales contra la COVID-19 han mitigado el impacto de la pandemia al disminuir las infecciones sintomáticas, las hospitalizaciones y las muertes. El miedo excesivo que alguna vez prevaleció se ha disipado en gran medida gracias al desarrollo de estas vacunas y de tratamientos eficaces. Sin embargo, a medida que el SARS-CoV-2 ha seguido evolucionando antigénicamente75, las infecciones irruptivas se han vuelto comunes76, lo que ha provocado, como mínimo, grandes alteraciones en nuestra vida diaria. Por lo tanto, se necesitan modalidades de prevención adicionales. Si se demuestra que es seguro, el 7DW8-5 podría ser otra herramienta en nuestra lucha contra la COVID-19 y otras infecciones por virus respiratorios, lo que también provocaría una enorme pérdida económica. La fuerza del agonista CD1d residiría en las respuestas rápidas a infecciones virales emergentes desconocidas cuando las vacunas y otros enfoques específicos de virus aún están bajo investigación. En este sentido, también existe la posibilidad de un uso alternativo del glicolípido 7DW8-5, como adyuvante de vacunas74. En conclusión, este glicolípido inmunoestimulante podría aplicarse prácticamente mediante diversas estrategias para responder a futuros brotes o pandemias causadas por un virus respiratorio emergente, antes y durante el desarrollo de fármacos y vacunas.

Se utilizó un análisis de potencia basado en las directrices del Instituto para la Investigación de Animales de Laboratorio para predeterminar el tamaño de la muestra y estimar el número mínimo de animales necesarios para detectar un efecto significativo del glicolípido 7DW8-5, si se detecta alguno. Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de donantes de sangre anónimos de leucopacks proporcionados por el New York Blood Center (NYBC). El NYBC no selecciona a los donantes por motivos de género o raza, pero se asegura de que todos los donantes sean mayores de 18 años. Por lo tanto, el trabajo que realizamos no requirió la aprobación del Comité de Revisión Institucional. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Política sobre cuidado y uso humanitario de animales de laboratorio del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia (Garantía de Bienestar Animal n.º D16-00003) y la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington (Garantía de Bienestar Animal n.º A3381–01). Las inoculaciones de virus se realizaron bajo anestesia inducida y mantenida con clorhidrato de ketamina y xilazina, y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales. Se sacrificó a ratones y hámsteres con CO2, haciendo todo lo posible para minimizar el sufrimiento.

Ratones BALB/c hembra de 10 a 15 semanas de edad y ratones C57BL/6 hembra de 14 a 15 semanas de edad, así como ratones BALB/c hembra que carecen de los genes CD1d1 y CD1d2 (cepa: C.129S2-Cd1tm1Gru/J) y ratones hembra C57BL/6 que carecen de IFN-\(\gamma\) (cepa: B6.129S7-Ifngtm1Ts/J) se adquirieron en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en las instalaciones para animales. en el Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia. Se obtuvieron ratones hembra heterocigotos de 8-9 semanas de edad K18-hACE C57BL/6J (cepa: 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) del Laboratorio Jackson y se alojaron en una instalación para animales libre de patógenos en la Escuela de la Universidad de Washington. de Medicina. Se compraron hámsteres sirios machos con 5 a 6 semanas de edad en Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y se alojaron en una instalación de nivel 3 de bioseguridad mejorada (BL3) en la Universidad de Washington en St. Louis.

Glicolípido 7DW8-5 con fórmula química [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopiranosil)-N-(11-(4-fluorofenil)undecanoil)-2-amino-1,3,4 -octadecanotriol)] se sintetizó como se describió anteriormente44. Glicolípido α-galactosil ceramida (α-GalCer) con fórmula química [N-[(3S,4R)-3,4-dihidroxi-1-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- trihidroxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]oxioctadecan-2-il]hexacosanamida] y lípidos de control con fórmula química 18:1 caproilamina PE [1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-( hexanoilamina)] y biotinilo PE 18:1 [sal sódica de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinilo)] se adquirieron de Avanti Polar Lipids.

Se cultivaron células Vero-E6 (ATCC Cat #1586) y Vero-TMPRSS2-ACE2 (obsequio de la Universidad de Emory) a 37 °C en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, HEPES 10 mM. pH 7,3 y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. Huh7, una línea celular de hepatocarcinoma humano, se adquirió de la Colección Japonesa de Biorecursos de Investigación (JCRB0403) y se cultivó en las mismas condiciones que las células Vero-E6. El SARS-CoV-2 MA10, variante Delta (B.1.617.2) y variantes Omicron, virus BA.1 y BA.5, se obtuvieron de BEI (n.º de catálogo NR-55329, NR-55691, NR-56475 y NR -58616). El stock de Omicron se propagó en células Vero-TMPRSS2 como se describe7, mientras que otros aislados de SARS-CoV-2 se propagaron en células Vero E6 para este estudio como se describe77. El clon infeccioso ic-SARS-CoV-2, WA1/mNeonGreen se obtuvo del Centro de Referencia Mundial para Virus y Arbovirus Emergentes (WRCEVA) de la Rama Médica de la Universidad de Texas y se propagó y tituló en células Vero-E6 antes de su uso. Todo el trabajo con SARS-CoV-2 infeccioso se realizó en instalaciones aprobadas BSL3 y A-BSL3 en el Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia o en la Universidad de Washington utilizando respiradores de aire de presión positiva y equipos de protección adecuados. Las células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) (Cat # CCL-34) y las células HEp-2 (Cat # CCL-23) se adquirieron de la ATCC. La cepa PR/8/34 del virus de la influenza A (H1N1) (N.° de cat. VR-95) y el aislado A2 del virus sincitial respiratorio humano (VRS) (n.° de cat. VR-26PQ), adquiridos en ATCC, se propagaron y titularon en MDCK y Hep-2. células, respectivamente bajo condición BSL2. Las células Hep-2 adquiridas en ATCC (n.º de catálogo CCL-23) han sido registradas por el Comité Internacional de Autenticación de Líneas Celulares como una línea celular derivada de la contaminación con HeLa, pero han sido validadas para la propagación del aislado (RSV) A2 en el laboratorio antes. a experimentos de titulación.

Los cornetes nasales se obtuvieron de ratones como se describe78. Brevemente, se diseccionó y se eliminó completamente la piel del cráneo y la nariz, y se seccionó el cráneo en el plano coronal. Luego se extrajo el resto de la parte anterior del cráneo. Después de retirar la cara posterior de la base del cráneo, se insertó la tijera en la cavidad nasal posterior. Luego se realizó una incisión bilateral en la línea de sutura, revelando el tabique nasal. La tijera separó los dos maxilares (lateralmente) y el hueso etmoides (medialmente) a lo largo de la distinta línea de sutura. Finalmente, se retiraron el paladar superior y la punta nasal anterior para completar la disección. Para el cornete nasal de hámster, el cornete nasal se extrajo quitando primero la piel a lo largo del costado de la nariz y las mejillas. Luego se cortó la mandíbula dejando al descubierto el paladar del hámster. Se realizó una incisión sagital a través del paladar exponiendo el cornete nasal que se extrajo con unas pinzas romas. El cornete nasal se homogeneizó en 1 ml de DMEM suplementado con 2% de FBS, l-glutamina y 1% de HEPES. El homogeneizado se centrifugó a 1000 g durante 5 min. Se pesó el tejido pulmonar completo después de separarlo de los bronquios y otros tejidos no pulmonares, se colocó en un tubo BioMasher II (Diagnocine LLC) con 250 µl de medio DMEM suplementado con FBS al 2% inactivado por calor y se homogeneizó manualmente girando el molinillo hacia adelante y hacia atrás. hasta que todo el tejido estuvo completamente homogeneizado. Posteriormente, los homogeneizados de tejido en los tubos se centrifugaron a 1000 g a 4-10 ° C durante 10 min. Tanto para los cornetes nasales como para los homogeneizados de pulmón, el sobrenadante se recogió y se almacenó a -80 °C para la detección del título viral y la carga viral.

Para configurar el ensayo de titulación TCID50 se utilizaron homogeneizados de cornetes nasales y pulmonares de ratones y hámsteres desafiados y tratados con 7DW8-5 o solución salina recolectados en las instalaciones ABSL3. Se agregaron diluciones seriadas de 2 veces de las muestras a una placa de 96 pocillos sembrada con 2 x 104 células Vero-E6 a 37 ° C bajo 5% de CO277. Tres días después, se puntuaron visualmente los pocillos para determinar el efecto citopático (CPE, observado mediante microscopía óptica) de las células en cada dilución, para determinar el punto final TCID. Para el ensayo de UFP, se sembraron células Vero-TMPRSS2-ACE2 a una densidad de 1,25 x 105 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, el medio se reemplazó con 200 microlitros de diluciones seriadas de muestra 10 veces, diluidas en DMEM + FBS al 2%. Una hora más tarde, se añadió 1 ml de recubrimiento de metilcelulosa. Las placas se incubaron durante 72 h, luego se fijaron con paraformaldehído al 4% (concentración final) en PBS durante 1 h. Las placas se tiñeron con cristal violeta al 0,05% (p/v) en metanol al 20% y se lavaron dos veces con agua destilada y desionizada. Se contaron las placas y se calcularon los títulos según un método descrito previamente79.

Para la titulación de RSV, se diluyeron en serie homogeneizados de pulmón de solución salina o de ratones tratados y expuestos con 7DW8-5 4 veces y se superpusieron sobre una capa confluente de células Hep-259. También se diluyó en serie un estándar de control de virus del aislado A2 utilizado para infectar a los ratones y se ejecutó en paralelo para comparar el CPE resultante. Las células infectadas y de control se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % durante 5 días. Se observó CPE viral bajo microscopio para cada dilución. Utilizando el método de dilución de criterio de valoración, se calculó la TCID50 por grupo de tratamiento.

Para la titulación del virus de la influenza PR8, se recolectaron homogeneizados de pulmón de ratones tratados con solución salina o 7DW8-5 el día 5 después del desafío con 200 UFP de virus PR8/A/34 por ratón. Los homogeneizados se diluyeron en serie tres veces y se superpusieron sobre una capa confluente de células de riñón canino Martin Delaney (MDCK). El aislado PR8/A/34 también se diluyó en serie y se usó como control positivo. Las células se incubaron a 33 °C/5 % de CO2 y los sobrenadantes se recogieron a las 72 h para determinar la actividad de la neuraminidasa viral de cada pocillo utilizando un ensayo de fluorescencia80,81 con el kit de ensayo de neuraminidasa NA-Fluor Influenza (Applied Biosystems). La producción del producto fluorogénico 4-metilumbeliferona se leyó en un lector de microplacas Spectramax i3X utilizando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. Los controles negativos que utilizan sobrenadantes de células no infectadas sirven como blanco para el ensayo. Los datos de fluorescencia se recopilaron utilizando el software Softmax Pro 7.0.2. El criterio de valoración para cada muestra se calculó como un aumento de 3 veces o más de la actividad de la neuraminidasa en comparación con los controles. Se calculó la TCID/g de pulmón para cada muestra y se representó utilizando GraphPad Prism v9.3.

Los ensayos histológicos e inmunohistoquímicos se realizaron como se describe51,55. Inmediatamente después de la eutanasia, se recogió el lóbulo del pulmón izquierdo y se fijó sumergiéndolo en formalina tamponada con fosfato al 10% durante la noche, seguido de inmersión en etanol al 70% durante hasta una semana, lo que fue suficiente para desinfectar los virus. El tejido fijado se embebió manualmente en parafina y se prepararon secciones con un espesor de 4 µm. Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina (Richard Allan Scientific, San Diego, CA). Para la inmunohistoquímica, la recuperación del antígeno se realizó con una solución desenmascaradora de antígeno (tampón citrato de pH 6,0, H-3300, Vector Laboratories, Newark, CA), seguida de una incubación con peróxido. Las secciones de tejido se incubaron primero con el anticuerpo primario, mAb de conejo de la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 (26369, Cell Signaling, Danvers, MA) durante la noche, y luego con el anticuerpo secundario, el anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP (MP7401, Vector). Laboratorios). Luego, la señal se amplificó utilizando un kit de tinción DAB (NC9567138, Fisher Scientific, Waltham, MA) y se contratiñó con hematoxilina. Finalmente, los tejidos se escanearon en mosaico utilizando un escáner de diapositivas Aperio AT2 (Leica Biosystems, Deer Park, IL) y las imágenes se capturaron con un Aperio ImageScope (Leica Biosystems, Deer Park, IL).

El ARN total se aisló de los cornetes nasales con el micro kit miRNeasy (Qiagen, 217084) según las instrucciones del fabricante. Se añadió el kit ERCC RNA Spike-In Mix (ThermoFisher Scientific, 4456740) al ARN total normalizado antes de la preparación de la biblioteca siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas de secuenciación de ARN se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra II para Illumina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.). Las muestras fueron secuenciadas por el instrumento Illumina HiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando una configuración de extremo emparejado (PE) de 2x150 pb. Después del estricto control de calidad de los datos sin procesar, las lecturas de secuencia se recortaron para eliminar posibles secuencias adaptadoras y nucleótidos de mala calidad utilizando Trimmomatic v.0.36. Las lecturas recortadas se asignaron al genoma de referencia de Mus musculus disponible en ENSEMBL utilizando el alineador STAR v.2.5.2b. Los archivos BAM se generaron como resultado de este paso. Los recuentos de aciertos de genes únicos se calcularon utilizando la función Counts del paquete Subread v.1.5.2. Solo se contaron las lecturas únicas que se encontraban dentro de las regiones de exones. Después de la extracción de los recuentos de aciertos de genes, la tabla de recuentos de aciertos de genes se utilizó para el análisis de expresión diferencial posterior. Utilizando DESeq2, se realizó una comparación de la expresión génica entre los grupos de muestras.

Para la neutralización de IFN-\(\gamma\), se administró a ratones un anticuerpo anti-IFN-\(\gamma\) de ratón (BioXCell; clon XMG1.2) o un control de isotipo IgG1 de rata (BioXCell; clon HRPN) mediante inyección intraperitoneal. en el día -1 (0,5 mg) y el día 0 (0,5 mg) en relación con la inoculación de MA10.

El lavado broncoalveolar (BAL) se realizó como se describe82. Brevemente, después de sacrificar al ratón, el animal fue colocado boca arriba sobre una placa quirúrgica. Después de realizar una incisión en la piel del cuello cerca de la tráquea con un bisturí, se expuso la tráquea rodeada por el músculo esternohioideo. Después de colocar un hilo de algodón debajo de la tráquea con unas pinzas, se perforó cuidadosamente el centro de la tráquea expuesta entre dos anillos de cartílago con una aguja de 26 G. Luego, se insertó el catéter de aproximadamente 0,5 cm en la tráquea y se estabilizó atando la tráquea alrededor del catéter usando el hilo de algodón colocado. Se conectó al catéter una jeringa de 1 ml cargada con 1 ml de solución salina equilibrada estéril con EDTA 100 µM y la solución de sal/EDTA se inyectó suavemente en el catéter. Luego se aspiró suavemente la solución mientras se masajeaba el tórax del ratón. Se retiró la jeringa de la aguja y el líquido de lavado recuperado se transfirió a un tubo de 15 ml colocado sobre hielo.

Los sueros, así como los sobrenadantes, se recogieron mediante centrifugación de cornetes nasales (NT), lavado bronquioalveolar (BAL) y homogeneizados de pulmón (LH) de ratones tratados con 7DW8-5 un día antes. También se recogieron sueros y sobrenadantes de ratones tratados con solución salina un día antes. Eve Technologies Corporation (Calgary, AB, Canadá) analizó los sueros y los sobrenadantes en busca de citocinas y quimiocinas utilizando su Mouse Cytokine/Chemokine 31-Plex Array (MD31).

Las células mononucleares de pulmón (MNC) se recolectaron como se describe83. Como se muestra en la figura complementaria 5a, primero se perfundieron los pulmones con PBS que contenía colagenasa IV y DNasa1. Se prepararon suspensiones de células individuales mediante disociación mecánica del tejido pulmonar a través de una malla de nailon de 70 μm, luego se colocaron en capas sobre Ficoll-Paque (Sigma) y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 20 minutos a 900 g. Después de recolectar MNC de pulmón de la interfase del gradiente, las células se incubaron con anticuerpo anti-receptor de Fc de ratón (BioLegend, Cat # 101320) para bloquear la unión del anticuerpo no específico. Luego, cada muestra se tiñó con anticuerpo CD45 anti-ratón marcado con ficoeritrina (BioLegend, Cat # 103106) durante 30 minutos. Justo antes de clasificar las células, se añadió DAPI (dilución x 10.000). Las células viables se clasificaron mediante FACS Aria II seleccionando células positivas para CD45 negativas para DAPI, seguido del análisis con el software FlowJo v10.8.1, como se muestra en la figura complementaria 5b.

Las bibliotecas scRNA-Seq y scTCR-Seq se prepararon utilizando los kits de reactivos 5' unicelulares de cromo 10x v2 (índice dual), según las instrucciones del fabricante. En resumen, después de la clasificación de las células, se cargaron suspensiones unicelulares en el controlador Chromium para producir gotitas a escala de nanolitros con perlas de gel 5' con códigos de barras exclusivos llamadas GEM (emulsiones de perlas de gel). Después de GEM-RT, las GEM se limpiaron con perlas Dyna MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific, 37002D). De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el ADNc se amplificó y se seleccionó el tamaño mediante perlas SPRI (Beckman Coulter, B23317). Finalmente, las bibliotecas de transcripción 5 'y TCR-seq se combinaron y secuenciaron con el sistema Illumina NovaSeq 6000.

Los archivos FASTQ se procesaron mediante el software Cell Ranger v.6.1.2 (10x Genomics) utilizando el genoma GRCm38 (GENCODE vM23/Ensembl 98) como referencia. Los datos analizados en R usando el paquete Seurat v.4.1.0 se fusionaron e integraron usando un método de integración de datos unicelular basado en anclajes en Seurat84. Se excluyeron las células con un contenido de ARN mitocondrial superior al 5%. Los genes de características variables se establecieron en 2000 genes. Una vez que se integraron los conjuntos de datos, los datos se ingresaron en un análisis de componentes principales (PCA) basado en genes variables. Se utilizaron los mismos componentes principales para generar Proyecciones y Aproximaciones de Múltiples Uniformes (UMAP). Los grupos se identificaron mediante agrupación compartida basada en el vecino más cercano (basada en SNN). Para el análisis de agrupamiento se utilizaron las funciones RunUMAP, FindClusters y FindNeighbors en Seurat. La secuenciación de TCR de células individuales se alineó y cuantificó utilizando el software cellranger-vdj (v.6.1.2). Para el análisis de los datos se utilizó el archivo de salida filtered_contig_annotations.csv.

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 8 donantes sanos utilizando el gradiente Ficoll Paque Plus (Merck Millipore, MA, Cat# GE17-1440-02). Se agregaron PBMC a placas de 96 pocillos con fondo en U (0,5 x 106 células/pocillo) por duplicado y se estimularon con 7DW8-5 a una concentración final de 0,1 y 1 mM. Paralelamente, las PBMC también se trataron con PE 18:1 a una concentración final de 1 mM. Las PBMC se estimularon durante 24 h a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5%. En las últimas 4 h, se añadió Brefeldin A a 10 mg/ml y se incubó durante las 4 horas adicionales. Después de eso, los sobrenadantes de PBMC se recogieron y almacenaron para el análisis del IFN-γ secretado mediante Luminex (Invitrogen, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las PBMC se lavaron y se tiñeron con PE-Cy7 anti-CD3 (clon: SK7), PERCP Cy5.5 anti-TCRVα24 (clon: C15), AF647 anti-CD161 (clon: HP3G10), AF700 anti-CD8 (clon: RPA- T8) y APC-Cy7 anti-CD69 (clon: FN50), durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpo anti-IFN-γ humano durante 40 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se lavaron con solución de lavado dos veces y se resuspendieron en PBS para una adquisición citométrica de flujo inmediata. Para la adquisición de FACS, se adquirieron 1 × 105 linfocitos utilizando un citómetro de flujo BD LSR Fortessa (BD Biosciences, San José, CA). La adquisición de datos se realizó utilizando el software FACS DIVA (BD Biosciences, San José, CA) y el análisis de datos utilizando el software FlowJo (versión 10.6.2, BD Biosciences, San José, CA).

Se establecieron líneas celulares iNKT humanas y células HeLa transfectadas con el gen CD1d humano, HeLa-hCD1d, como informamos anteriormente44. Se cocultivaron veinte mil líneas celulares iNKT humanas de 3 donantes diferentes con 2 × 104 HeLa-hCD1d en un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos en presencia de 1 µg/ml de glicolípido 7DW8-5, 18:1 PE. o solución salina (controles). Después de 24 h de incubación, se recogieron los sobrenadantes cultivados y se estimó la presencia de IFN-γ mediante ELISA.

Los sobrenadantes recolectados de líneas celulares iNKT humanas estimuladas se diluyeron en serie (2 veces) y se incubaron en una monocapa de células Huh7 durante la noche a 37 C/5% de CO2 durante 20 h. Se utilizó una dilución seriada de 5 veces de proteína IFN-γ humana recombinante como control positivo (Gibco cat# PHC4031). Además, los sobrenadantes se combinaron y mezclaron con anticuerpo anti-IFN-γ humano (1 µg/ml) (BioXcell Cat# BE0235) para comprobar efectos específicos y no específicos. Después de esta incubación, las células se infectaron con el aislado ic-SARS-CoV-2-mNeon64 y se incubaron más durante 24 h en condiciones similares. Después de 24 h, las células se examinaron bajo un microscopio fluorescente para enumerar las células GFP+ y el porcentaje de inhibición se calculó como la diferencia de fluorescencia en los pocillos de prueba en comparación con los pocillos que no recibieron tratamiento (solo virus) y se representó gráficamente usando GraphPad Prism v9.3.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los materiales utilizados en este estudio estarán disponibles, pero pueden requerir la ejecución de un acuerdo de transferencia de materiales. Todos los datos se proporcionan en el artículo o en la Información complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento. Los datos de secuenciación de ARNm para comparar la expresión genética diferencial y los datos de secuenciación de ARN asociados con experimentos de secuenciación de ARN unicelular se han puesto a disposición en el servidor del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) a través de la base de datos ArrayExpress utilizando los códigos de acceso E-MTAB-12345 para ARNm y E. -MTAB-11770 para la secuenciación unicelular. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este estudio fue apoyado por fondos para DDH de la Fundación JPB, Andrew y Peggy Cherng, Samuel Yin, Carol Ludwig, David y Roger Wu. Los experimentos con ratones y hámsteres transgénicos K18-hACE2 se realizaron en la Universidad de Washington con el apoyo de los NIH: R01 AI157155 (para MSD), 75N93019C00051 (para MSD), 75N93021C00016 (para ACMB) y U01 AI151810 (para MSD y ACMB).

Estos autores contribuyeron igualmente: Moriya Tsuji, Manoj S. Nair, Kazuya Masuda, Candace Castagna.

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Moriya Tsuji, Manoj S. Nair, Kazuya Masuda, Yukiko Tsuji, Yaoxing Huang y David D. Ho

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10032, EE. UU.

Moriya Tsuji, Manoj S. Nair, Kazuya Masuda, Yaoxing Huang y David D. Ho

Instituto de Medicina Comparada, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10032, EE. UU.

Candace Castaña & Laura Corredor

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Zhenlu Chong, Tamarand L. Darling, Kuljeet Seehra, Adrianus CM Boon y Michael S. Diamond

Centro Columbia para el Desarrollo Humano, Alergia Pulmonar y Medicina de Cuidados Críticos, Departamento de Medicina, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10032, EE. UU.

Youngmin Hwang y Munemasa Mori

Laboratorio de Virología Básica y Aplicada, Departamento de Microbiología, Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil

Ágata Lopes Ribeiro, Geovane Marques Ferreira y Jordana Grazziela Alves Coelho-dos-Reis

Departamento de Microbiología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Adrianus CM Boon y Michael S. Diamante

Departamento de Patología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

Adrianus CM Boon y Michael S. Diamante

Centro Andrew M. y Jane M. Bursky para programas de inmunología e inmunoterapia humana, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, 63110, EE. UU.

michael s.diamante

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Médicos y Cirujanos Vagelos de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10032, EE. UU.

David D. Lo

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MT, MSN, YT, YH y DDH concibieron el proyecto. MT, CC, LC y ZC realizaron los experimentos con ratones. TLD y KS realizaron los experimentos con hámster. MSN, ZC, TLD, KS e YH realizaron los experimentos de titulación de virus. KM realizó los análisis unicelulares con 10X Genomics. YH y MM realizaron el análisis histológico. ALR y GMF contribuyeron al ensayo de citometría de flujo. MT, MSN, KM, JGAC-d.-R, YT, ACMB, MSD y DDH analizaron los resultados. MT y DDH escribieron el manuscrito con contribuciones de cada autor.

Correspondencia a Moriya Tsuji, Yaoxing Huang o David D. Ho.

MT, MSN, YH y DDH figuran como co-inventores en una solicitud de patente provisional presentada por la Universidad de Columbia para el tratamiento de COVID-19 y otras infecciones respiratorias virales utilizando 7DW8-5 descrito en este manuscrito. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a David Markovitz, el otro revisor anónimo, por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Tsuji, M., Nair, MS, Masuda, K. et al. Un glicolípido inmunoestimulante que bloquea las infecciones por SARS-CoV-2, RSV e influenza in vivo. Nat Comuna 14, 3959 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39738-1

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Recibido: 27 de enero de 2023

Aceptado: 27 de junio de 2023

Publicado: 05 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39738-1

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Reseñas de la naturaleza Microbiología (2023)

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