La disminución del flujo del corazón izquierdo en fetos de corderos causa hipoplasia del corazón izquierdo y pro

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 770 (2023) Citar este artículo

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A menudo se conjetura que el flujo sanguíneo bajo a través del corazón izquierdo fetal es una etiología del síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS). Para investigar si una disminución en el flujo del corazón izquierdo resulta en un retraso en el crecimiento, generamos una obstrucción del flujo de entrada del ventrículo izquierdo (LVIO) en fetos de corderos en mitad de la gestación mediante la implantación de bobinas en su aurícula izquierda mediante una técnica percutánea guiada por ultrasonido. Una LVIO significativa recapitula características clínicas importantes del HLHS: disminución del flujo de la válvula aórtica anterógrada, perfusión retrógrada compensatoria del cerebro y la aorta ascendente (AAo) desde el conducto arterial, hipoplasia grave del corazón izquierdo, un VI que no forma ápice y una capa endocárdica engrosada. Los AAo hipoplásicos tienen pares de miARN-genes que contribuyen a la proliferación celular y que se expresan de manera inversamente diferencial mediante ARN-seq en masa. La secuencia de ARN de un solo núcleo del miocardio del VI hipoplásico muestra un aumento de fibroblastos con una disminución recíproca en las proporciones de los núcleos de cardiomiocitos. Los fibroblastos, cardiomiocitos y células endoteliales del miocardio hipoplásico tienen una mayor expresión del componente de la matriz extracelular o genes de fibrosis con una señalización desregulada del factor de crecimiento de fibroblastos. Por lo tanto, una reducción grave y sostenida (~ 1/3 de la gestación) en el flujo del corazón izquierdo del feto es suficiente para causar hipoplasia del corazón izquierdo. Esto se acompaña de cambios en la composición celular y la expresión genética compatibles con un entorno profibrótico y una inducción aberrante de programas mesenquimales.

La hipoplasia del ventrículo izquierdo (VI) es un componente de muchas formas de cardiopatía congénita. En su forma más grave, el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), todas las estructuras del corazón izquierdo son diminutas y no pueden soportar la circulación sistémica. A pesar de la cirugía reconstructiva, los resultados clínicos del HLHS no son óptimos: supervivencia del 64% o 74% al año1 y del 59% o 64% a los 6 años2, dependiendo del tipo de cirugía. Sólo ~50% de los pacientes con HLHS llegan a los 18 años de edad y en la edad adulta temprana enfrentan múltiples desafíos, incluida la insuficiencia cardíaca3.

La etiología de la hipoplasia del VI sigue siendo incierta y es probable que sea heterogénea. En algunos fetos, la hipoplasia del VI puede volverse evidente después de completar la cardiogénesis, marcada por el cierre del tabique ventricular a las 9,1 semanas de gestación humana (etapa 22 de Carnegie). En el contexto específico del SHLHS, la aparición de insuficiencia del crecimiento del VI después de la cardiogénesis está respaldada por la observación de que se encuentra un tabique ventricular intacto en el patrón anatómico más común del SHLHS (estenosis o atresia de las válvulas aórtica y/o mitral)4. 5,6, y que la progresión de la estenosis aórtica fetal grave a HLHS se ha documentado repetidamente en el segundo o tercer trimestre del embarazo7. La consecuencia hemodinámica del cierre del tabique ventricular es que el llenado del VI fetal se vuelve más precario: depende por completo del flujo a través de la válvula auriculoventricular izquierda y ya no puede compensarse con el flujo a través del tabique ventricular.

Se planteó la hipótesis de que las fuerzas hemodinámicas desempeñan un papel en la etiología del HLHS y los modelos animales han demostrado que el flujo sanguíneo afecta el desarrollo y el crecimiento de las estructuras cardiovasculares. Una disminución del 70% en el flujo de la arteria carótida de conejo durante 2 semanas resultó en una disminución del diámetro dependiente del endotelio que era resistente a la vasodilatación8. En embriones de pez cebra, la obstrucción del flujo de entrada o salida ventricular tuvo efectos profundos en la morfogénesis del corazón, incluida la formación de válvulas y la diferenciación de cámaras; un fallo de crecimiento distal se atribuyó a menores fuerzas de corte sobre las células endocárdicas9. En embriones de pollo tempranos, la ligadura unilateral de la vena vitelina provocó malformaciones estructurales de las arterias del arco faríngeo y del corazón10,11,12. El defecto cardíaco resultante, más comúnmente una anomalía del tabique ventricular o de las válvulas semilunares, dependía del grado de reducción del flujo13. En embriones de pollo más viejos después de la cardiogénesis, la obstrucción del flujo de entrada del corazón izquierdo resultó en una disminución del crecimiento del corazón14.

En humanos y otros mamíferos, la base del crecimiento cardíaco fetal es la proliferación de miocitos15,16,17,18 con una disminución del índice mitótico antes del nacimiento19. El conocimiento actual es que después del nacimiento, la proliferación de cardiomiocitos continúa ralentizándose y, en la vida adulta, el recambio es <1% anual del conjunto total20,21. Por tanto, el crecimiento posnatal del corazón se debe principalmente a un aumento del volumen de los cardiomiocitos individuales (hipertrofia) y a la proliferación del tejido intersticial20. La cuantificación de la composición celular del corazón a partir de secciones de tejido requiere estereología15,17 o dispersión del corazón seguida de nuevos protocolos de citometría de flujo22 (Tabla S1). Los cardiomiocitos son particularmente difíciles de cuantificar debido a su morfología, tamaño, multinucleación y falta de marcadores nucleares23. La transcriptómica unicelular (o de un solo núcleo) es un método poderoso para estudiar tejidos complejos a nivel de una sola célula y ha permitido obtener conocimientos sin precedentes sobre la composición celular de los corazones en desarrollo24,25. La secuenciación de ARN unicelular en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de pacientes con HLHS encontró señalización endocárdica anormal26 y defectos intrínsecos en la diferenciación y maduración de cardiomiocitos27.

En 1978 se propuso un modelo de HLHS en fetos de mamíferos que utilizaba la obstrucción del flujo de entrada o salida del VI. La obstrucción del flujo de entrada del VI (LVIO) en fetos de corderos provocó una muerte prematura en 2 a 7 días, con una disminución del 17% en la relación entre el ventrículo izquierdo y el derecho ( RV) peso28. La colocación de bandas aórticas supravalvulares fue mejor tolerada que la LVIO en estos fetos de cordero y las mediciones de la autopsia sugirieron hipoplasia del VI28. En estudios más recientes, utilizando ecocardiografía, la colocación de bandas aórticas supravalvulares en fetos de cordero no produjo consistentemente hipoplasia del corazón izquierdo, sino que resultó en hipertrofia/dilatación del VI29. Hasta la fecha, los intentos de crear modelos de fetos de cordero con HLHS han sido técnicamente desafiantes.

Para explorar la patogénesis de la insuficiencia de crecimiento del corazón izquierdo en un mamífero grande, disminuimos el flujo del corazón izquierdo generando un modelo de estenosis mitral en un feto de cordero que comienza en 0,52 y termina en 0,84 de gestación. Desde el 0,51 al 0,97 de gestación, el número de cardiomiocitos en la pared libre del VI del feto de cordero aumenta aproximadamente linealmente de 0,6 a 2,4 × 109 células30. Entre el 0,75 y el 0,84 de gestación, se estima que entre el 5% y el 10% de los cardiomiocitos están activos en el ciclo celular, lo que da como resultado un aumento del 30% en el número de cardiomiocitos31. Por lo tanto, nuestro modelo de estenosis mitral fetal explora el efecto de disminuir el flujo del corazón izquierdo durante un período de crecimiento cardíaco por hiperplasia. Utilizando la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq), estudiamos la composición del tipo celular, las inferencias de linaje y la expresión genética diferencial en el miocardio del VI hipoplásico.

Los intentos iniciales de disminuir el flujo del corazón izquierdo llenando el VI fetal con espirales (n = 11) no tuvieron éxito ya que los corderos murieron de forma aguda o la taquicardia ventricular inducida por las espirales impidió la implantación de un número suficiente de espirales para disminuir el flujo del corazón izquierdo. Esto fue a pesar de la diferente edad gestacional (65 a 121 días) en el momento de la implantación, el diámetro de la bobina y la ruta de entrada de la aguja al VI: directamente a través de la pared del VI o a través de la luz de la válvula mitral desde la aurícula izquierda (LA). Dado que la entrada al corazón a través de la AI fue mejor tolerada, colocamos una mayor cantidad de espirales solo en la AI y observamos un llenado insuficiente agudo del VI en un feto en el día 121 que murió dentro de una semana. Habiendo observado un efecto agudo, el enfoque de desplegar espirales completamente dentro de la AI se repitió a una edad más temprana (n = 2, 97 días): esto fue tolerado y en el día 130, un feto tuvo flujo retrógrado en la AAo, una AAo hipoplásica en comparación con la PA, y un VI con formación de ápice y tamaño normal pero con relleno insuficiente. Esto nos animó a intentar la implantación de espirales en la AI incluso antes (~76 días, 0,52 de gestación) y con la posibilidad de una mayor duración del flujo cardíaco izquierdo bajo (hasta ~124 días, 0,84 de gestación; Fig. 1a). Estos fetos de cordero son el tema de este informe.

a Esquema del estudio: implantación de la bobina aproximadamente a los 76 días (0,52 de gestación) y reevaluación aproximadamente 48 días después. La ecocardiografía fetal y la recolección de tejido para histología, volumen y snRNA-seq se realizaron a ~124 días (0,84 de gestación). b Se estudiaron cuarenta y siete fetos de corderos. Trece controles no tuvieron intervención (n = 12 sobrevivieron). A 34 fetos de cordero se les implantaron espirales y 15 sobrevivieron hasta 0,84 de gestación: cinco tenían un flujo de válvula aórtica normal y un corazón izquierdo normal, nueve fetos tenían un flujo de válvula aórtica disminuido con flujo retrógrado compensatorio en la aorta ascendente y habían desarrollado hipoplasia del corazón izquierdo (no -ápice formando ventrículos izquierdos en cuatro). La hidropesía fetal en un feto fue secundaria a una insuficiencia mitral grave inducida por un espiral. El feto de control que murió era el gemelo de un cordero que recibió espirales. AAo aorta ascendente, ventrículo izquierdo VI, arteria pulmonar PA, ventrículo derecho VD.

Se utilizaron cuarenta y siete corderos en 24 ovejas (6 embarazos únicos, 13 gemelares y 5 trillizos): a 34 fetos se les implantaron espirales auriculares izquierdas a los 76 (RIC: 75, 80) días o 0,52 (RIC: 0,51, 0,54) de gestación. y 13 eran controles no instrumentados (Fig. 1b y Tabla S2). Diecinueve de 34 (56%) fetos enrollados murieron debido a la instrumentación y al cambio circulatorio agudo. Doce (92%) controles y quince (44%) fetos enrollados sobrevivieron los 46 (RIC: 45, 48) días o 0,31 (RIC: 0,31,0,33) de gestación hasta la evaluación ecocardiográfica a los 124 (RIC: 123, 125) días o 0,84. (RIC: 0,84, 0,85) gestación (Figs. 2a, b y S1). Uno de los 15 fetos enrollados supervivientes era gravemente hidrópico (peso fetal de 10 kg), secundario a una regurgitación mitral grave inducida por el espiral y no se incluyó en análisis adicionales.

Vista ecocardiográfica de cuatro cámaras de un control (a) y un ventrículo izquierdo hipoplásico (b). c Flujo retrógrado en la aorta ascendente. d–g Corazones expuestos después de una esternotomía. d Control con el ventrículo izquierdo formando el ápice; e Hipoplasia intermedia del corazón izquierdo con ambos ventrículos formando el ápice; f Hipoplasia grave del corazón izquierdo con el ventrículo derecho formando el vértice; g Hipoplasia intermedia del corazón izquierdo, con AAo hipoplásica. h Aurícula izquierda desde arriba, con tejido creciendo y cubriendo las espirales, creando una obstrucción del flujo de entrada del ventrículo izquierdo en nuestro modelo de estenosis mitral. i Ventrículo izquierdo severamente hipoplásico, pared libre del ventrículo izquierdo abierta. AAo aorta ascendente, ventrículo izquierdo VI, arteria pulmonar PA, ventrículo derecho VD.

En los 14 fetos enrollados restantes, la gravedad de la LVIO se evaluó mediante la presencia de flujo retrógrado a través de la aorta ascendente32 que compensa el flujo anterógrado deficiente a través de la válvula aórtica (Figs. 2c y S1). Los fetos con (i) ninguna o mínima LVIO tuvieron un flujo anterógrado normal a través de la válvula aórtica y ningún flujo retrógrado en la AAo (n = 5), mientras que aquellos con (ii) LVIO tuvieron un flujo retrógrado en la AAo (n = 9; Fig. 2c). Cinco de los fetos con flujo retrógrado en la AAo tenían LVIO intermedio con algo de flujo de la válvula aórtica restante, y cuatro tenían LVIO severo, sin flujo de la válvula aórtica anterógrada y solo perfusión retrógrada del cerebro y las arterias coronarias desde el conducto arterial.

La ecocardiografía y la autopsia confirmaron que los cinco corazones en espiral con flujo anterógrado normal a través de la válvula aórtica tenían muy pocas o ninguna espiral dentro de la aurícula izquierda (probablemente debido a la embolización temprana de la espiral fuera del corazón), o las espirales se encontraban lejos de la válvula mitral. en la aurícula izquierda posterior/apéndice auricular izquierdo y no produjo LVIO. Los nueve fetos con LVIO mostraron insuficiencia de crecimiento del VI. Los corazones con la LVIO más grave (n = 4) tenían hipoplasia del corazón izquierdo, incluidos los VI que no forman ápice (Fig. 2f). Aquellos con grados intermedios de VIIO (n = 5) tenían corazones izquierdos pequeños, pero con una falla de crecimiento menos grave, por ejemplo, el VI aún compartía el vértice con el VD (Fig. 2e).

Los fetos enrollados y de control fueron desde embarazos únicos hasta trillizos, lo que resultó en una variación considerable en el tamaño. Su peso osciló entre 1,74 y 5,12 kg (controles: 3,0 ± 0,78 kg, enrollados con flujo AAo retrógrado: 3,28 ± 0,68 kg; p = 0,39; Tabla S2), excluyendo al feto hidrópico. Debido al gran rango de tamaño fetal, las mediciones del corazón izquierdo se normalizaron con respecto a las correspondientes estructuras del corazón derecho o al peso total del corazón. Peso de la pared libre del VI (-39% de media), dimensiones telediastólicas del VI (diámetro: -52% de media; longitud: -29% de media) y diámetros de la válvula aórtica (-38% de media) y AAo (-30% de media). media) se redujeron significativamente en los VI de bajo flujo en comparación con los controles (Tabla 1). Nuestro modelo demostró una falla de crecimiento dependiente del flujo del corazón izquierdo fetal, que recapituló las características distintivas del HLHS humano, incluida la perfusión retrógrada del cerebro y las arterias coronarias del conducto arterial.

En los VI hipoplásicos, en comparación con los controles, la capa endo/subendocárdica varió en espesor pero fue más gruesa en todas partes (p = 0,015) y tenía fibras de Purkinje prominentes en secciones teñidas con tricrómico elástico (Fig. 3, S2 y S3). La capa subendocárdica del miocardio de los VI hipoplásicos estaba menos densamente empaquetada y el edema puede haber contribuido al engrosamiento. No hubo evidencia de elastosis endocárdica, inflamación o aumento de fibrosis en el miocardio debido a los VI hipoplásicos, cuando lo examinó un patólogo clínico y lo confirmó mediante tinción con rojo Picro-Sirius; sin embargo, hubo varias regiones con aumento de la tinción del tejido conectivo subendocárdico en tejidos enrollados. (Figuras 3 y S4). La apoptosis evaluada mediante ensayos TUNEL no se encontró ni en los ventrículos hipoplásicos ni en los de control (Fig. S5).

El endocardio más grueso de los ventrículos izquierdos hipoplásicos tiene una mayor tinción de colágeno (a, b, azul; c, d, rojo). Tinción con tricrómico elástico: a Control; b hipoplasia grave del corazón izquierdo. Tinción con rojo Picro-Sirio: control c; d hipoplasia grave del corazón izquierdo.

Realizamos una secuenciación masiva de ARN principalmente para permitir una anotación de novo del transcriptoma de O. aries para mejorar el mapeo y la anotación de los datos de snRNA-seq. También evaluamos la expresión diferencial de ARNm y miARN en AAo (n = 4 hipoplásicos, n = 2 controles) y LV (n = 4 hipoplásicos, n = 4 controles). Observamos una alta correlación entre réplicas biológicas (muestras del mismo tejido y condición; >0,88 para AAo y >0,91 para LV). También notamos una variación entre muestras, que puede superar los efectos del enrollado en algunas muestras (Fig. S6) y puede estar relacionada con algunas muestras que tienen números de integridad de ARN (RIN) bajos. Después de eliminar los valores atípicos, identificamos 64 genes significativamente regulados positivamente y 85 genes regulados negativamente en AAo (Figura S7a; la regulación positiva se refiere a una mayor expresión en fetos enrollados). Los análisis de vías de genes expresados ​​de manera significativamente diferencial revelaron un enriquecimiento de los componentes celulares de la periferia celular (p = 0,022) y la membrana plasmática (p = 0,029; Datos complementarios 1). Además, identificamos 4 miARN regulados positivamente en AAo (Fig. S8a). Para tres de esos miARN, encontramos genes diana significativamente regulados a la baja (Fig. S8b), incluidos genes implicados en el crecimiento y la proliferación celular (DDIT4, HS6ST2) y la adhesión celular (NRXN3, IGFS3, HS6ST2). Para el LV, descubrimos 4 genes significativamente regulados al alza y 13 a la baja (Fig. S7b), enriquecidos para los procesos de diferenciación de las células de grasa parda. También identificamos 4 miARN regulados positivamente y 7 regulados negativamente (Fig. S9a). Entre los miARN con mayor regulación positiva se encontraba el miR-15a-5p. En ratones, la sobreexpresión de miembros de la familia miR-15 se asoció con la retirada del ciclo celular de los cardiomiocitos y un tamaño de corazón más pequeño33. Dos miARN regulados positivamente tenían genes diana significativamente regulados negativamente, y tres miARN regulados negativamente tenían genes objetivo significativamente regulados positivamente (Fig. S9b). Los miARN "nuevos" adicionales en AAo y LV no pudieron coincidir con sus respectivos ortólogos y, por lo tanto, no se evaluaron. Si bien los valores bajos de RIN requieren interpretaciones cautelosas, encontramos miARN expresados ​​diferencialmente y genes diana asociados con el crecimiento, la proliferación y la adhesión celular. Sin embargo, no pudimos atribuir cambios a tipos de células o vías biológicas específicas.

Para evaluar más a fondo los cambios en la composición celular del miocardio y la expresión genética diferencial específica del tipo de célula, realizamos snRNA-seq en muestras de pared libre del VI. Capturamos 17,245 núcleos de corazones izquierdos en espiral, severamente hipoplásicos (n = 4 fetos con flujo mínimo o nulo a través de la válvula aórtica y sin regurgitación mitral) y 12,992 núcleos de controles (n = 3 fetos no instrumentados; Fig. S10). Identificamos tres grupos de cardiomiocitos (0, 3, 10), dos grupos de fibroblastos (1, 2), un grupo de células de músculo liso (6), dos grupos de células endoteliales (5, 15), un grupo de células endoteliales linfáticas. células (12), dos grupos de adipocitos (8, 9), dos grupos de leucocitos (4, 11) y un grupo de células neurales (13) (Figs. 4a y S11). Ningún tipo de célula fue exclusivo del miocardio hipoplásico o de control (Tabla S3). Dentro de los tipos de células, hubo una marcada heterogeneidad en la expresión genética. En comparación con los otros grupos de cardiomiocitos, el grupo 0 enriquecido en estructuras de unión de actina (actinina, discos z, uniones adherentes célula-célula) indica un papel en la estabilidad mecánica, mientras que los grupos de cardiomiocitos 3 y 10 enriquecidos en genes implicados en la biosíntesis de proteínas. Estos grupos de cardiomiocitos pueden representar diferentes etapas de maduración de cardiomiocitos34. Dentro de los fibroblastos, el grupo 1 se enriqueció con genes implicados en la biosíntesis de proteínas, incluidos los marcadores de fibroblastos tradicionales, como los componentes de la matriz extracelular. El grupo 2 está enriquecido en canales iónicos y podría representar un subtipo de fibroblastos predominantemente implicados en la comunicación celular35.

a Gráficos UMAP de núcleos de ventrículos izquierdos control (izquierda) o enrollados (hipoplásicos) (derecha). Se asignaron grupos a los principales tipos de células cardíacas: adipocitos (8, 9), cardiomiocitos (0, 3, 10), células endoteliales (5, 15), fibroblastos (1, 2), leucocitos (4, 11), células endoteliales linfáticas. células (12), células neurales (13) y células del músculo liso (6). b El grupo 7 expresó genes relacionados con el ciclo celular (fase G2, mitosis). c Los núcleos del grupo 7 se reagruparon y se mostraron con nuevas coordenadas: adipocitos (7.4), cardiomiocitos (7.0, 7.3), fibroblastos (7.1, 7.5), indefinido (7.2). d Diagramas de caja (proporciones de núcleos: mediana y rangos intercuartílicos) en ventrículos izquierdos enrollados (hipoplásicos) y de control, que muestran un aumento significativo en la proporción de fibroblastos (*) y una disminución no significativa en los núcleos de cardiomiocitos. Datos numéricos en la Tabla S5. Tamaño de la muestra: n = 3 controles biológicamente independientes, n = 3 corderos enrollados biológicamente independientes.

Los grupos 7 y 15 se enriquecieron en genes relacionados con la fase G2/mitosis (Fig. 4b), lo que sugiere una alta actividad del ciclo celular. Constituían sólo un pequeño porcentaje del número total de núcleos, sin diferencias obvias entre las condiciones experimentales (grupo 7: control 2,8%, enrollado 2,3%; grupo 15: control 0,3%, enrollado 0,3%. Prueba de Wilcoxon entre la proporción de células tipos no identificaron diferencias significativas). Los análisis de expresión de genes marcadores identificaron el grupo 15 como células endoteliales. Como no pudimos asignar todo el grupo 7 a uno de los principales tipos de células cardíacas, realizamos un subgrupo (Fig. 4c) e identificamos cardiomiocitos cíclicos (grupos 7.0, 7.3), fibroblastos cíclicos (grupos 7.1, 7.5) y cíclicos. adipocitos (grupo 7.4; Fig. S12 y Tabla S4). En particular, el número de cardiomiocitos en ciclo fue consistente con la tinción de Ki67 en la literatura16.

A continuación, evaluamos si el miocardio de los VI hipoplásicos solo difería en cantidad o si la composición había cambiado. Los mamíferos grandes tienen colecciones focales prominentes de adipocitos epicárdicos que pueden hacer que las muestras de miocardio no sean representativas; una muestra de VI enrollada se excluyó del análisis de composición porque tenía una alta proporción de adipocitos (Tabla S5 y Fig. S13). Analizamos la composición celular por la proporción de cada tipo de célula en muestras de VI de control e hipoplásicas mediante dos métodos: una prueba exacta de Fisher (Fig. S14 y Tabla S6) y regresión logística multinomial de Dirichlet (scCODA36 bayesiano y Reg de Dirichlet frecuentista37,38 ( Tabla S7).Todos los análisis encontraron un aumento significativo en los fibroblastos. Tanto scCODA como DirichletReg encontraron un aumento de ~ 1,4 veces en los fibroblastos, correspondiente al 20,1% de los núcleos en los controles frente al 28,7% en la miocardia hipoplásica (Fig. 4d y Tabla S7). Por el contrario, la fracción de núcleos de cardiomiocitos disminuyó en el miocardio hipoplásico (59,1% frente a 52,7%; Fig. 4d). Esta disminución fue significativa con el FET, pero no con scCODA o DirichletReg, probablemente debido a la mayor variabilidad de la muestra. en el recuento de cardiomiocitos (Tabla S3).

Aunque estudiamos un único momento del desarrollo (0,84 gestación), cada "tipo de célula" se compone de un espectro de estados celulares, algunos de los cuales son transitorios. Estudiamos la dinámica de la expresión génica mediante inferencia de linaje para los tipos de células más abundantes: fibroblastos, cardiomiocitos y células endoteliales (Fig. 5, 6, S15, S16 y S17). Los subgrupos de fibroblastos y cardiomiocitos activos del ciclo celular se excluyeron de nuestro análisis de pseudotiempo porque el análisis de regresión del ciclo celular sugirió que se trataba de células maduras en ciclo, en lugar de una variedad que se diferenciaba en tipos de células maduras. Los pseudopuntos temporales a lo largo de la variedad de fibroblastos se asociaron con la respuesta a la señalización de TGF-beta, estímulos externos y sustancias químicas (Datos complementarios 2 y Fig. S15). Al comparar los fibroblastos del miocardio hipoplásico versus el de control, identificamos genes expresados ​​diferencialmente a lo largo del eje del pseudotiempo. Los genes regulados positivamente en los corazones izquierdos hipoplásicos participaron en la organización y composición de la matriz extracelular (ELN, COL12A1, FMOD, MATN4, ITGA7, BGN, AEBP1, KERA, GPC5) y en la morfogénesis de las válvulas cardíacas (ELN, HEY2, CYR61). Los genes regulados negativamente se asociaron a la superficie celular (IQGAP2, ABCA1; Fig. 5 y Datos complementarios 2). Se identificaron vías similares cuando se analizó la expresión genética diferencial por grupo (Datos complementarios 3). La variedad de cardiomiocitos se asoció con la proliferación celular y la regulación del crecimiento, el acoplamiento eléctrico y la contracción celular mediada por actina (Datos complementarios 2 y figura S16). Los cardiomiocitos de corazones izquierdos hipoplásicos expresaron niveles más altos de componentes de la matriz extracelular (ELN, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A2, ITGB6, MFGE8) y genes implicados en la morfogénesis (MYOM2, ELN, COL1A1, EYA4, HEY2, MFGE8, CYR61, CNTN4, ASTN2). , ANGPT1, COL1A2, COL3A1, ADIPOQ, FLNA). Los genes regulados positivamente también estuvieron involucrados en la señalización beta del factor de crecimiento transformante (TGF) (COL1A1, COL1A2, COL3A1, SOX5) y la señalización de integrinas (ITGB6, MFGE8, CYR61, COL3A1; Fig. 6 y Datos complementarios 2). También encontramos desregulación de genes relacionados con la contracción cardíaca, como la regulación negativa de TPM2 y la regulación positiva de MYL4. La expresión de MYL4 (que codifica una cadena ligera de miosina fetal) puede mejorar la contractilidad del miocardio y se encontró en una variedad de cardiopatías congénitas y miocardiopatías39,40. La inferencia del linaje endotelial reveló una asociación de genes relacionados con la transducción de señales, la migración celular, el crecimiento y la unión a la matriz extracelular. La expresión genética diferencial sugirió una regulación positiva de los constituyentes de la matriz extracelular (VCAN, ELN, FN1, TNXB) y genes asociados con la unión de glicosaminoglicanos (VCAN, FN1, SLIT2, TNXB; Datos complementarios 2 y Fig. S17). Por lo tanto, los componentes de la matriz extracelular estaban regulados positivamente en los tres tipos de células, lo que sugiere una inducción de programas mesenquimales (Fig. S18).

un colector de fibroblastos (controles y muestras enrolladas agrupadas). b Mapa de calor que representa genes expresados ​​diferencialmente durante pseudotiempo, controles (izquierda) y ventrículos izquierdos enrollados (hipoplásicos) (derecha). c Análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO) de genes expresados ​​diferencialmente. Tamaño de la muestra: n = 3 controles biológicamente independientes, n = 4 corderos enrollados biológicamente independientes.

un colector de cardiomiocitos (controles y muestras enrolladas agrupadas). b Mapa de calor que representa genes expresados ​​diferencialmente durante pseudotiempo, controles (izquierda) y ventrículos izquierdos enrollados (hipoplásicos) (derecha). c Análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO) de genes expresados ​​diferencialmente. Verde: proceso biológico; Naranja: componente celular; Azul: función molecular. Tamaño de la muestra: n = 3 controles biológicamente independientes, n = 4 corderos enrollados biológicamente independientes.

CellChat es un análisis exploratorio que identifica pares ligando-receptor regulados diferencialmente por tipo de célula. Utilizando CellChat, predijimos diferencias en la comunicación celular entre control y bobinado. Detectamos 32 vías de señalización enriquecidas entre los 8 grupos de células, incluidas las señales de colágeno, IGF, FGF, NOTCH y VEGF (Fig. 7a, b). Si bien los patrones de la red de comunicación fueron similares en los controles y las muestras hipoplásicas, las señales de salida fueron en general más fuertes en los fibroblastos de control (Fig. 7a). La comunicación diferencial de las interacciones ligando-receptor sugirió alteraciones en la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El receptor de FGF, FGFR1, tuvo una mayor expresión en células endoteliales del VI hipoplásico, mientras que FGF2 se encontró regulado positivamente en adipocitos y células endoteliales (Fig. 7c, d). La expresión del receptor de VEGF estaba desregulada en células linfáticas (FLT4; VEGFR3) y endoteliales (KDR; VEGFR2), mientras que su ligando VEGFA estaba regulado positivamente en cardiomiocitos de miocardio hipoplásico (Fig. 7e, f). Se proporcionó evidencia adicional mediante análisis diferencial utilizando MAST (Datos complementarios 3).

La comunicación celular se comparó entre muestras de VI “control” y “en espiral” utilizando las cuatro medidas de centralidad de red de CellChat. Mapas de calor de intensidad de comunicación mediante molécula de señalización (filas) y tipo de célula (columnas) que muestran patrones salientes (a) y entrantes (b). Los diagramas de barras marginales representan la intensidad de señalización total para cada tipo de célula (asociada a columnas) o vía de señalización (asociada a filas). Gráficos de violín de la expresión génica normalizada dentro de la vía del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (c) y la vía VEGF (e), vías de señalización reguladas positivamente en espiral biológicamente relevantes que también contienen pares de receptor-ligando regulados diferencialmente específicos en espiral. Gráficos circulares que modelan la comunicación dentro de la vía FGF (d) y la vía VEGF (f), a través de diferentes tipos de células. Tamaño de la muestra: n = 3 controles biológicamente independientes, n = 4 corderos enrollados biológicamente independientes.

En general, nuestro modelo de cordero de LVIO sugiere que el crecimiento de las estructuras del corazón izquierdo a mitad de la gestación depende del flujo. Los datos de snRNA-seq indican una mayor fracción de fibroblastos y una regulación positiva de genes relacionados con la matriz extracelular y la remodelación de tejidos en varios tipos de células. El modelado de comunicación celular sugirió alteraciones en la señalización de FGF y VEGF. Estos hallazgos se asociaron con una capa subendocárdica más gruesa de tejido conectivo pero sin fibrosis global, lo cual era apropiado para esta etapa del desarrollo prenatal.

Creamos un modelo experimental de HLHS mediante la implantación de espirales en la aurícula izquierda de fetos de corderos para reducir gradualmente el flujo sanguíneo hacia el VI a mitad de la gestación, mucho después de que se completara la cardiogénesis. El modelo recapituló características clínicas importantes del HLHS fetal, incluida la disminución del flujo de la válvula aórtica anterógrada, la perfusión retrógrada del cerebro, la hipoplasia grave del corazón izquierdo y un VI que no forma ápice. El miocardio de los VI hipoplásicos no tenía fibrosis manifiesta sino una capa subendocárdica engrosada de tejido conectivo, y los análisis transcriptómicos revelaron cambios cuantitativos y cualitativos en la composición celular, la expresión génica y las redes de señalización intercelular.

El intervalo abarcado por nuestros experimentos con fetos de cordero (gestación de 0,52 a 0,84) corresponde a 20 a 34 semanas de gestación humana. Se ha observado que la estenosis aórtica fetal humana progresa a HLHS durante este período7, lo cual se predice por la presencia de flujo retrógrado en el arco aórtico transverso32. La gravedad de la alteración del flujo en nuestro modelo se puede estimar para la AAo: el flujo anterógrado normal a través de la AAo y las arterias coronarias es de 35 a 40% y ~4% del gasto ventricular combinado, respectivamente. En fetos sin flujo anterógrado de AAo, la AAo es sólo un conducto para las arterias coronarias y, por tanto, tiene sólo una décima parte del volumen de flujo normal en la dirección opuesta41. Una disminución tan severa y sostenida en el flujo de entrada del VI fue suficiente para causar un crecimiento reducido de las estructuras aguas abajo, lo que resultó en VI que no forman vértices, con válvulas aórticas pequeñas y AAo (Fig. 2 y Tabla 1).

La base celular y molecular del crecimiento cardiovascular es un área activa de investigación. A partir de la secuenciación masiva de ARN, algunos de los miARN expresados ​​diferencialmente se asociaron con la proliferación celular y la interrupción del ciclo celular, por ejemplo, miR-15a-5p33. Sin embargo, a partir de la expresión genética combinada de miles de células de diferentes tipos y estados, no pudimos inferir una respuesta global clara del tejido miocárdico al flujo cardíaco izquierdo bajo. Por lo tanto, utilizamos snRNA-seq para investigar la respuesta de distintos tipos de células miocárdicas en términos de cambios en su población y sus transcriptomas36. El cambio principal en la composición celular fue un aumento de ~1,4 veces en la proporción de fibroblastos del 20,1% (controles) al 28,7% (en espiral) de los núcleos, lo cual fue consistente en todas las muestras. Dado que las proporciones suman la unidad, si un tipo de célula aumenta en proporción, hay una disminución obligada en otros. En nuestro miocardio hipoplásico del VI, esto se limitó a una disminución en los núcleos de cardiomiocitos (Fig. 4d) del 59,1% (controles) al 52,7% (en espiral). Por lo tanto, la falla del crecimiento del VI en nuestro modelo LVIO se asoció con un cambio en las fracciones de tipo celular, lo que implica que las señales mecánicas del flujo sanguíneo y la precarga diastólica tuvieron un efecto diferencial sobre la proliferación y/o diferenciación de fibroblastos y cardiomiocitos. Los transcriptomas de los ventrículos hipoplásicos en el 0,84 de gestación (75 días después del inicio de LVIO) reflejan procesos de remodelación de tejidos en lugar de vías de señalización de respuesta temprana. Se descubrió que múltiples tipos de células, incluidos fibroblastos, cardiomiocitos y células endoteliales, tenían una mayor expresión de los componentes de la matriz extracelular (Fig. S18). La inferencia de grupos conocidos de ligando-receptor y el modelado de redes de comunicación celular predijeron la señalización alterada dentro de las vías de FGF y VEGF (Fig. 7)42,43,44,45. Una regulación positiva de los colágenos u otras proteínas de la matriz extracelular en las células endoteliales es una de las características de la transición endotelial a mesenquimatosa (EndMT), y se ha descubierto que tanto la señalización de FGF2 a través de FGFR1 como la señalización de VEGF-A a través de VEGFR2 protegen o inhiben contra EndMT46,47 ,48,49. Por lo tanto, los VI hipoplásicos presentaban características que sugerían una inducción aberrante y ectópica de la señalización mesenquimatosa y profibrótica, incluida la expresión regulada positivamente de los componentes de la matriz extracelular, una mayor abundancia de fibroblastos y desregulaciones de la señalización de FGF y VEGF como posibles anti-EndMT. respuestas (Discusión complementaria).

De acuerdo con esos cambios celulares y moleculares, la miocardia hipoplásica tenía una capa demostrativamente más gruesa de tejido conectivo subendocárdico. En niños con HLHS, una gruesa capa endocárdica de tejido fibroelástico celular, denominada fibroelastosis endocárdica (EFE), se asoció con EndMT patológica y se consideró predictiva de resultados clínicos, por ejemplo, después de intervenciones fetales50,51. Si bien en este modelo de feto de cordero con HLHS no hubo fibrosis grave en la histología, la mayor parte de la matriz de colágeno cardíaco se desarrolla posnatalmente52,53. Por lo tanto, una respuesta fibrótica puede volverse más evidente después del nacimiento o si se superpone una sobrecarga de presión en la vida fetal, por ejemplo, por estenosis aórtica. En particular, se observó engrosamiento subendocárdico y fibrosis con depósito de colágeno en el modelo de ligadura auricular izquierda de embrión de pollo de HLHS54, y se encontraron defectos endocárdicos intrínsecos y EndMT anormal en HLHS iPSC26 humano. Incluso mejoras sutiles de la malla de colágeno entre y paralelamente a los miocitos52,53 podrían aumentar la rigidez del miocardio y limitar el crecimiento al moderar la transducción de señales mecánicas y actuar como una restricción física sobre el alargamiento y el crecimiento de los cardiomiocitos.

La demostración de hipoplasia del corazón izquierdo secundaria al bajo flujo del corazón izquierdo no socava la importancia de una predisposición genética al HLHS y a la enfermedad estructural del corazón izquierdo55. Más bien, demuestra el impacto de las fuerzas hemodinámicas en la traducción de genotipos a fenotipos, lo que resulta en algunas de las características morfológicas clínicamente más devastadoras del HLHS. La complejidad de las cascadas que traducen la variación genética en una enfermedad clínica se reflejan en la arquitectura genética heterogénea de las malformaciones del corazón izquierdo. Una amplia gama de variantes hereditarias raras y de novo contribuyen al espectro clínico, incluidos varios genes asociados con EndMT (FGFR2, FOXP1, GATA4, GJA1, NKX2-5, NOTCH1, NR2F2, SMAD3)27,56. Otras predisposiciones genéticas pueden dar lugar a anomalías cardíacas estructurales o funcionales que inevitablemente cambiarán el flujo cardíaco izquierdo, lo que a su vez da lugar a cambios morfológicos en el corazón en crecimiento, lo que representa una forma de interacción entre los genes y el entorno interno. La transducción de señales mecánicas, el flujo y la precarga diastólica también pueden ser vulnerables a la variación alélica. Una etiología compleja se ejemplifica en la herencia digénica (SAP130, PCDHA9) de la hipoplasia del corazón izquierdo con un defecto del tabique ventricular en el ratón Ohia57 y se refuerza por la aparición de enfermedad del corazón derecho en lugar de la izquierda (displasia/atresia de la válvula tricúspide) y extracardiopatía. anomalías cardíacas en cerdos editados como deficientes en SAP13058.

Las ovejas son la especie preferida para los estudios de la fisiología fetal de los mamíferos, especialmente si se requiere instrumentación. Sin embargo, imponen limitaciones significativas debido a su estacionalidad reproductiva, costo, conjunto de herramientas moleculares limitado y variedad de reactivos, por ejemplo, anticuerpos o ensamblajes genómicos anotados16,30. Los hallazgos iniciales de este modelo plantean inmediatamente preguntas que abordaremos en estudios futuros. Por ejemplo, ¿existe una ventana de desarrollo durante la cual las perturbaciones del flujo tienen un efecto y esto varía entre las estructuras del corazón izquierdo? Creemos que los efectos del flujo tendrán su mayor impacto mientras haya todavía una rápida proliferación de cardiomiocitos hasta ~0,75-0,9 de gestación16,30. Una vez que se produce la desaceleración perinatal de la proliferación de cardiomiocitos, hay pocas posibilidades de que la hiperplasia de cardiomiocitos recupere el crecimiento, y el crecimiento por hipertrofia puede verse limitado por la fibrosis. El desarrollo de nuevos agentes e intervenciones para el HLHS requiere una comprensión mecanicista y molecular de la hipoplasia del corazón izquierdo. Los modelos de hipoplasia del corazón izquierdo en mamíferos grandes serán esenciales para la evaluación preclínica de los tratamientos, ya sean quirúrgicos, cateterismo intervencionista o terapias farmacológicas. Esto incluye la exploración de agentes para promover la proliferación de cardiomiocitos y superar el estímulo de flujo fisiológico reducido y las limitaciones fibróticas. Nuestro modelo recapitula los patrones de flujo del HLHS fetal humano con perfusión retrógrada del cerebro y las arterias coronarias del conducto arterial, y también permitirá una evaluación del impacto de esta fisiología en el desarrollo de otros órganos, incluido el cerebro.

La aparición gradual de una obstrucción grave del flujo de entrada del ventrículo izquierdo a mitad de la gestación dio lugar a una disminución grave y sostenida del flujo del corazón izquierdo, que fue suficiente para provocar una hipoplasia inequívoca del corazón izquierdo. Esto implica que el crecimiento fisiológico del corazón izquierdo de los mamíferos fetales después de la cardiogénesis depende del flujo. El miocardio expuesto a un flujo sanguíneo bajo tenía una mayor fracción de fibroblastos y una regulación positiva de la matriz extracelular y de los genes de remodelación de tejidos en múltiples tipos de células, lo que sugiere una señalización ectópica de tipo mesenquimal. Una susceptibilidad a la remodelación profibrótica del tejido prenatal podría afectar aún más el crecimiento y la función cardíaca, incluido el resultado de las intervenciones fetales y posnatales tempranas.

Hemos cumplido con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación con animales. Todos los procedimientos siguieron las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el Consejo de Cuidado de Animales de la Universidad de Western Ontario (protocolo 2010-257). Ovejas preñadas Dorset × Rideau Arcott (edad gestacional 76 días, término 147 días) fueron ayunadas (16 h de sólidos, 6 h de agua) y premedicadas con ketoprofeno (3 mg/kg; Anafen, Boehringer Ingelheim). La anestesia se indujo con 7 a 20 mg/kg de pentotal sódico intravenoso (IV) (normalmente ~ 1 g en una vena yugular interna; Abbott Laboratories Ltd, Montreal, Canadá) y se mantuvo con 1 a 3 % de isoflurano y 5 a 6 l/min. O2. Las ovejas fueron monitoreadas mediante frecuencia cardíaca, presión arterial, oximetría de pulso y capnografía al final de la espiración. Luego se utilizó ultrasonido para determinar el tamaño de la camada y, si se detectaban múltiples, para decidir qué feto tenía la mejor posición para la implantación de la bobina.

Las bobinas se implantaron en el corazón izquierdo bajo guía ecográfica continua (Philips HDI 5000), mediante un abordaje completamente percutáneo en estrictas condiciones de asepsia. Esta técnica fue adaptada de la utilizada en nuestra práctica clínica para intervenciones cardíacas fetales humanas59. Se utilizó una aguja de 20 G (Quincke de 6”; Beckton-Dickinson) para colocar espirales de platino (IDC de 0,018”, Boston Scientific) por encima de la válvula mitral hasta que el VI pareció insuficientemente lleno y el flujo aórtico ascendente disminuyó o se volvió retrógrado. Se administró profilaxis antibiótica durante 3 días después del procedimiento (trimetoprim-sulfadoxina; 16 mg/kg im Trivetrin, Schering-Plough). Más información sobre el sexo y la edad de los fetos en la Tabla S2.

Cuarenta y cinco a cincuenta días después de la implantación de la espiral (0,84 de gestación), se anestesiaron las ovejas y se realizaron ecocardiogramas fetales para medir las dimensiones telediastólicas y telesistólicas del VI y VD, los diámetros de la válvula aórtica, la válvula pulmonar, la aorta ascendente (AAo) y arteria pulmonar principal (PA; Tabla S2). Se utilizó un mapeo de flujo de color para evaluar las características del flujo de la válvula mitral, aórtica, ductal y del tabique interauricular.

Bajo anestesia general materna y después de una ecocardiografía fetal, los fetos de corderos nacieron mediante histerotomía. Se pinza el cordón umbilical y se sacrifica al cordero con pentobarbital sódico intravenoso (BimedaMTC, Cambridge, Canadá). Se utilizó una esternotomía mediana para recolectar el corazón, luego se tomaron muestras de los ventrículos izquierdo (VI), ventrículos derechos (VD), AAo y AP principal del feto. El tejido se congeló instantáneamente con N2 líquido y se almacenó a -80 °C (análisis de transcriptoma) o se fijó en formalina al 4% (histología). La oveja fue sacrificada con pentobarbital una vez que se extrajeron todos los fetos.

Se obtuvieron muestras de miocardio del ventrículo izquierdo de fetos de cordero (n = 4 corazones izquierdos con hipoplasia grave, n = 7 controles). Después de la fijación en formalina al 4% durante 24 h, el tejido se transfirió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) fresca durante 3 días, etanol al 70% durante 7 días, luego se bloqueó y se embebió en parafina. Las tinciones se realizaron en las instalaciones STTARR (Centro de innovación para la investigación preclínica avanzada de imágenes y radiación), Toronto, Canadá (tricrómico elástico y TUNEL) o en el Centro de fenogenómica, Toronto, Canadá (Picro-Sirius Red). Se utilizó tinción con tricrómico elástico para evaluar la histología y el espesor endo/subendocárdico. La apoptosis se evaluó mediante el ensayo TUNEL. La deposición de tejido conectivo y colágeno se evaluó mediante tinción con rojo Picro-Sirius.

La tinción con tricrómico elástico es una combinación de la tinción elástica de Verhoeff y el tricrómico de Masson, que se utiliza para diferenciar el colágeno del músculo liso y demostrar las fibras elásticas. Se cortaron secciones en serie de 4 a 5 μm de espesor en un plano transversal, se desparafinaron y se rehidrataron en xileno (3 × 2 min), etanol al 100% y al 95% y agua. Las secciones se incubaron en solución mordiente de Bouin (Polysciences Inc) durante 1 hora a 56 ° Celsius, se lavaron en agua durante 10 minutos, luego se tiñeron con tinte elástico Verhoeff (ver más abajo) durante 1 hora y se lavaron en agua destilada. Las secciones se diferenciaron microscópicamente en cloruro férrico al 2% hasta que las fibras elásticas se distinguieron y el fondo fue de incoloro a gris claro. Las secciones se tiñeron en solución de escarlata de Biebrich y fucsina ácida durante 2 minutos, se enjuagaron con agua destilada, se colocaron en una solución de ácido fosfotúngstico al 5% durante 15 minutos, se tiñeron con una solución de color verde claro al 2% durante 10 minutos y se colocaron en una solución de ácido acético al 1% durante 30 minutos. s, deshidratados con 95% y 100% etanol + xileno, y luego montados con medio de montaje sintético. Tinción elástica de Verhoeff: hematoxilina alcohólica al 5% (30 ml), solución de cloruro férrico al 10% (12 ml), yodo de Lugol (12 ml; yoduro de potasio 100 mg/mL; y yodo 50 mg/mL).

Se cortaron secciones en serie de 4 a 5 μm de espesor en un plano transversal, se desparafinaron y se rehidrataron en xileno (2 x 5 min), etanol al 100%, 95%, 70% (5 min) y agua. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó en H2O2 al 3% en 1x PBS durante 15 min. Las secciones se lavaron en agua durante 5 min. La digestión enzimática se realizó con 10 μg/ml de Proteinasa K en 1x PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se rodearon con una pluma de Papanicolaou y se lavaron en 1 x PBS-T durante 2 x 3 minutos. Se aplicó una solución bloqueadora de proteínas sin suero, 2 a 3 gotas por portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente (Dako). La enzima TdT se preparó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Terminal Transferase, Biotin-16-dUTP; Roche) y las secciones se incubaron durante 1 h a 37 °C. Las secciones se lavaron en 1x PBS-T durante 3 x 3 min, se incubaron en el kit Vectastain ABC durante 30 min a temperatura ambiente (Vector Laboratories), se lavaron en 1 x PBS-T durante 3 x 3 min, se incubaron en el kit de sustrato DAB durante 10 min (Abcam), se lavó en agua durante 5 min, se deshidrató a través de una serie de alcohol graduado, se aclaró en xileno y se montó en cubreobjetos.

Azul Celestino (Azul Celestino 2,5 g, Alumbre de Hierro (sulfato férrico amónico) 25 g, Agua destilada 500 ml). Rojo Picro-Sirius (rojo Sirius F3B acuoso al 0,1% (CI 35780) 5 ml, ácido pícrico acuoso saturado 45 ml). Se cortaron secciones en serie de 5 μm de espesor en un plano transversal, se desparafinaron en xileno (3 cambios, en total 3 min), se sumergieron en etanol al 100 % (3 cambios, 10 inmersiones cada una), se transfirieron a agua y se tiñeron con azul celestina durante 5 min. , se lavó en agua, se tiñó con hematoxilina de Harris durante 5 min, se lavó con agua, se diferenció en alcohol ácido (5 inmersiones), se lavó en agua y se tiñó con Pico-Sirius Red durante 30 min. Después del secado por transferencia, las secciones se deshidrataron en etanol al 100% (4x), xileno (3x, 10 inmersiones cada una), se cubrieron con un cubreobjetos y se montaron en porciones. Resultados: Colágeno, reticulina, membrana basal – roja. Con microscopía polarizante: Fibras grandes – birrefringencia amarilla o naranja; fibras delgadas – birrefringencia verde; colágeno tipo 4 – no birrefringente; núcleos – negro; elastina, músculo, citoplasma – amarillo.

El escaneo de portaobjetos se realizó en el Centro de Imágenes del Hospital para Niños Enfermos, Toronto, Canadá (microscopio de epifluorescencia Zeiss, objetivo 20x/0,75). Tinciones con tricrómico elástico y TUNEL: la visualización y el análisis de imágenes se realizaron con el software CaseViewer (3DHISTECH Ltd.). El espesor de la capa endo/subendocárdica (distancia entre el endotelio y la capa muscular en µm) se determinó en secciones teñidas con tricrómico elástico de las paredes libres del corazón izquierdo. Esta capa contenía endotelio, tejido conectivo endocárdico, subendocardio y fibras de Purkinje. Se realizaron múltiples mediciones de espesor en cada muestra (~cada 50–100 µm) y se realizó un análisis de medidas repetidas como un modelo lineal de efectos mixtos, con el tratamiento como un efecto fijo y la muestra como un efecto aleatorio. Tinciones Picro-Sirius Red: el análisis de imágenes se realizó con el software Halo (v3.1.1076.301). Las imágenes se analizaron utilizando una versión adaptada del algoritmo de cuantificación de Halo.

El ARN de las paredes libres del VI y el VD, AAo y PA se extrajo utilizando el mini kit miRNeasy (QIAGEN). Tres muestras procedían de corazones con hipoplasia grave (que también se utilizaron para la secuenciación de ARN de núcleo único) y una procedía de un corazón con hipoplasia moderada. Se secuenciaron cuatro muestras como controles. Las muestras de ARN tenían proporciones A260/A280 de 2,06 a 2,07 y se comprobó su integridad en un chip Agilent Bioanalyzer 2100 RNA Nano. La concentración se midió mediante el ensayo Qubit RNA HS en un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las muestras se enviaron para la preparación y secuenciación de pequeñas bibliotecas de ARN y agotamiento de ARNr en el Centro de Genómica Aplicada (TCAG), el Hospital para Niños Enfermos.

Para la secuenciación de ARN largo no codificante y ARNm poli(A), la preparación de la biblioteca RNA-Seq se realizó siguiendo el protocolo de preparación de la biblioteca de ARN total trenzado TruSeq (Illumina, EE. UU.) con el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero Gold. Brevemente, se utilizaron 600 ng de ARN total como material de entrada y se sometieron a agotamiento de ARNr utilizando perlas biotiniladas que contienen oligos específicos dirigidos a ARNr. Las muestras de ARN empobrecidas en ARNr se fragmentaron en rangos de 200 a 300 bases durante 4 minutos a 94 °C y se convirtieron en ADNc bicatenario, se repararon en los extremos y se adenilaron en el extremo 3' para crear un saliente A que permitiera la ligadura de Adaptadores Illumina con un saliente T. Los fragmentos de la biblioteca se amplificaron en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98 °C durante 10 s, seguida de 12 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, y finalmente un paso de extensión durante 5 min a 72 °C. En el paso de amplificación, cada muestra se amplificó con un adaptador con código de barras diferente para permitir la secuenciación múltiple. Se cargó un µl de cada una de las bibliotecas de RNA-seq en un chip Bioanalyzer 2100 DNA High Sensitivity (Agilent Technologies, EE. UU.) para verificar el tamaño y la ausencia de dímeros de cebador; Las bibliotecas de ARN se cuantificaron mediante qPCR utilizando el protocolo Kapa Library Quantification Illumina/ABI Prism Kit (Sigma Aldrich, EE. UU.). Las bibliotecas se agruparon en cantidades equimolares y se secuenciaron en pares en una plataforma NovaSeq 6000 (Illumina), utilizando 2 carriles de una celda de flujo S2 siguiendo el protocolo recomendado por Illumina para generar lecturas de extremos pares de 150 bases de longitud, lo que dio como resultado ~90 M pares. -lecturas finales por muestra.

La preparación de la biblioteca de ARN pequeña se realizó siguiendo el protocolo NEBNext Small RNA Library Prep Set para Illumina (para una muestra aórtica, la preparación de la biblioteca falló). Brevemente, se usaron 600 ng de ARN total para ligar adaptadores compatibles con Illumina del extremo 3', seguido de hibridación con el cebador de transcripción inversa que previene la formación de dímeros de adaptador; luego se ligaron adaptadores del extremo 5' al ARN pequeño, y las moléculas de ARN pequeñas ligadas al adaptador se transcribieron de forma inversa y se amplificaron mediante PCR con una desnaturalización inicial a 94 °C durante 30 s, seguida de 15 ciclos de 94 °C durante 15 s. 62 °C durante 30 s y 70 °C durante 15 s, y un paso de extensión final de 5 min a 70 °C. En el paso de amplificación, cada muestra se amplificó con un adaptador con código de barras diferente para permitir la secuenciación múltiple. Se cargó un µl de cada pequeña biblioteca de ARN en un chip de alta sensibilidad de ADN Bioanalyzer 2100 para comprobar el tamaño y la ausencia de dímeros de cebador. Las bibliotecas de ARN se cuantificaron mediante qPCR utilizando el protocolo del kit Kapa Library Quantification Illumina/ABI Prism. Para una muestra aórtica, la preparación de la biblioteca falló dos veces. Las bibliotecas se agruparon en cantidades equimolares y se secuenciaron en un solo extremo para 50 bases en 2 carriles de una celda de flujo en modo de ejecución rápida con la química de secuenciación V3 en una plataforma HiSeq 2500 (Illumina), siguiendo el protocolo recomendado de Illumina), lo que dio como resultado casi 8 millones de lecturas. por muestra.

Procesamiento de lecturas de secuenciación: utilizamos STAR y el genoma de oveja más actualizado "oviAri4" para mapear las lecturas. Se lograron tasas de mapeo deseables (85% –90%) para todas las muestras y alrededor del 80% de las lecturas mapeadas se asignaron con éxito a cuerpos genéticos anotados, lo que sugiere que la calidad general de los datos es alta y confiable. Se eliminaron de los análisis dos muestras de control de AAo (342284_2, 342287_1), ya que se encontró que expresaban altos niveles de genes miocárdicos (como NPPA, MYL4, ANKRD1, MYL7, MYPN y CSRP3), lo que indica una posible contaminación con tejido cardíaco. Los exones se contaron utilizando featureCounts para la anotación del genoma Oar_V4.0. La correlación de los valores de expresión genética entre todas las muestras se utilizó para evaluar la calidad del conjunto de datos.

Análisis de expresión diferencial: los recuentos se normalizaron con RUV-seq60 y los genes expresados ​​diferencialmente se calcularon utilizando edgeR (cambio de log2 veces> 1 y valor de p ajustado por tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,05). Brevemente, las lecturas pequeñas de RNA-seq tenían secuencias adaptadoras recortadas con el conjunto BBMap para mantener las lecturas con menos de 23 nucleótidos después del recorte. Las lecturas se alinearon con el genoma OviAri4 y la anotación Oar_v4.0 utilizando miRDeep2.

Procesamiento de lecturas de secuenciación: se utilizó FastQC (v0.11.7) para examinar la calidad de las lecturas secuenciadas (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Se utilizó BBDuk (BBMap suite v37.90) (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) para recortar secuencias de adaptadores de lecturas con secuencias de adaptadores de referencia proporcionadas por BBMap suite y configuraciones “hdist=1 mink=11” para pequeñas Lecturas de secuencia de ARN. Para la especificidad del tamaño de miARN, solo se retuvieron lecturas de <23 nucleótidos de longitud. Después del recorte, se utilizó FastQC para examinar la calidad de las lecturas secuenciadas recortadas. Se utilizó miRDeep2 mapper.pl61 con parámetros predeterminados para mapear lecturas de al menos 18 nucleótidos de longitud en el genoma de la oveja (Ovis aries) (Oar_v4.0). Los miRNA conocidos y nuevos se identificaron utilizando el algoritmo principal miRDeep2 (miRDeep2.pl) con parámetros predeterminados. Para los miARN conocidos, las secuencias de miARN maduros en ovejas se obtuvieron de miRBase (v22.1)62. Para los miARN nuevos, solo se retuvieron aquellos con una puntuación miRDeep ≥2 para el análisis posterior.

Análisis de expresión diferencial de miARN: el análisis de expresión diferencial de miARN se realizó en R (v4.0.3). En primer lugar, se excluyeron los nuevos miARN que aparecen en <75% de las réplicas dentro de un grupo de tratamiento de tejido determinado. En segundo lugar, los miARN nuevos y maduros con recuentos transformados logarítmicamente ≥1 en el 75% de las réplicas para una muestra de tratamiento de tejido determinada se retuvieron para análisis posteriores. Se aplicó RUV-seq (v1.24.0)60 para eliminar variaciones no deseadas utilizando muestras replicadas (RUV con k = 2). Se identificaron miARN expresados ​​diferencialmente (DE) (log2FC absoluto > 1, valor p ajustado por FDR < 0,05; Datos suplementarios 1) para el tratamiento – control dentro de cada tejido utilizando DESeq2 (v 1.30.1)63. Los log2FC encogidos se calcularon con un estimador de encogimiento "normal". Se utilizaron secuencias maduras de nuevos miARN DE para identificar homólogos de miARN conocidos en función de la similitud de secuencia en otras especies con la función de "búsqueda de secuencia única" en miRBase (v22.1) con el método de búsqueda SSEARCH.

Identificación del gen diana de miARN: Los genes diana predichos computacionalmente y validados experimentalmente de miARN expresados ​​diferencialmente en AAo y LV se identificaron utilizando multiMiR (v1.12.0)64. Para los genes objetivo validados experimentalmente, las fuentes se limitaron a "miRTarBase", "TarBase" y "miRecords" utilizando el parámetro "validado" en multiMiR. Se identificaron homólogos humanos de miARN DE a partir de una secuencia de miARN maduro con el método de búsqueda SSEARCH en miRBase (v22.1) y se utilizaron como entrada. Si no se pudieron identificar homólogos humanos, entonces el miARN DE se excluyó de la identificación del gen objetivo. Los genes diana potenciales se filtraron previamente para genes expresados ​​diferencialmente en AAo o LV con diferencias de expresión opuestas entre los tratados con bobina y el control en comparación con el miARN expresado diferencialmente en el mismo tejido respectivo. Por ejemplo, los genes diana de un miARN más expresados ​​en muestras de AAo tratadas con bobina se identificarían a partir de genes más expresados ​​en muestras de AAo de control. Luego, los genes diana identificados se convirtieron de ortólogos humanos a ovinos utilizando biomaRt (v2.46.3). Los ortólogos faltantes se recuperaron manualmente utilizando el recurso Gene del NCBI.

La secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) se realizó en el Centro de Genómica Princess Margaret, Toronto, Canadá. El diseño experimental consistió en cuatro muestras de corazón izquierdo hipoplásico de cordero y tres controles. El tejido de la pared libre del ventrículo izquierdo (30 a 50 mg por muestra) se disociaba mecánicamente en 1 a 2 mm3 utilizando hojas de afeitar frías (Fisher Scientific). Para aislar los núcleos, el tejido se suspendió en tampón de lisis (durante 5 minutos) y se homogeneizó utilizando un homogeneizador Dounce (Sigma-Aldrich). Los núcleos intactos se verificaron mediante tinción de gel de ARN SYBR Green II (concentrado 10.000X en DMSO; Thermo Fisher Scientific). Se contaron los núcleos resuspendidos y los sedimentos se lavaron dos veces en tampón de resuspensión. La resuspensión se filtró con un filtro celular Flowmi de 40 µm (Sigma-Aldrich) y se transfirió a un tubo LoBind de 1,5 ml (Sigma-Aldrich). Los núcleos se contaron nuevamente y se incubaron con DAPI (Sigma-Aldrich), en las concentraciones sugeridas por el fabricante. Para excluir desechos o agregados de núcleos, se realizó una clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con un clasificador de células BD Influx (BD Biosciences), seleccionando la positividad de DAPI (durante 1 a 1,5 h). Los núcleos se recogieron, se lavaron con tampón de resuspensión y luego se contaron. Se utilizó la tecnología de expresión génica unicelular de cromo 10x (3'v2 10x Genomics) para generar bibliotecas indexadas de forma única según los protocolos del fabricante. La secuenciación de ARN se realizó en una plataforma HiSeq X (LV 1 y 2) o NovaSeq 6000 (LV 3 y 4) (Illumina), según las recomendaciones del fabricante.

Sacarosa 0,32 mM (Sigma-Aldrich), CaCl2 5 mM (Sigma-Aldrich), Mg(Ac)2 3 mM (Sigma-Aldrich), Tris-HCl 20 mM 7,5 (Fisher Scientific), Triton X-100 al 0,1% (Sigma -Aldrich), EDTA 8.0 0,1 mM (Sigma-Aldrich), inhibidor de RNasa 40 U/ml (Sigma-Aldrich), en H2O destilada ultrapura libre de DNasa/RNasa (Fisher Scientific). Tampón de resuspensión: 1x PBS (pH 7,4; Thermo Fisher Scientific), 1 % de BSA (MACS Miltenyi Biotec) y 0,2 U/μl de inhibidor de RNasa (Sigma-Aldrich).

Se realizó un mapeo inicial de lecturas de snRNA-seq utilizando Cell Ranger v3 (10x Genomics) y un transcriptoma de referencia 'pre-mrna' (es decir, pre-splicing), derivado del ensamblaje del genoma NCBI 4.0 de O. aries. Este enfoque resultó en aproximadamente un 25 % de lecturas de secuenciación asignadas a supuestas regiones intergénicas. A modo de comparación, las muestras de snRNA-seq humano suelen producir <3% de lecturas que se asignan a regiones intergénicas. Nuestra hipótesis es que algunas de las supuestas regiones intergénicas de O. aries eran en realidad marcos de lectura abiertos sin anotaciones. Para probar esto, agrupamos mediciones de secuenciación masiva de ARN de LV, AAo, RV y PA para una anotación de novo del transcriptoma de O. aries, siguiendo los protocolos alternativos STAR 3 y 865, con el ensamblaje del genoma NCBI 4.0 como plantilla. Esto redujo la proporción de lecturas de snRNA-seq mapeadas a supuestas regiones intergénicas (es decir, aquellas no medidas mediante secuenciación masiva de ARN) a ~ 2,5% (Datos complementarios 4). Para análisis adicionales, utilizamos anotaciones de transcriptoma de novo, incluidas extensiones de las coordenadas genéticas del ensamblaje del genoma NCBI 4.0 y nuevos marcos de lectura abiertos (coordenadas proporcionadas en los Datos complementarios 5).

Las lecturas de secuenciación de un solo núcleo se asignaron al transcriptoma de referencia de novo utilizando Cell Ranger v3 (10x Genomics). Todas las muestras pasaron el control de calidad bioinformática (Datos complementarios 4). Medimos la expresión de 50 a 8000 genes por núcleo y menos de 30 000 identificadores moleculares únicos, que son indicadores de datos de buena calidad (por ejemplo, no sugieren una contribución importante de los dobletes de gotitas). Como se esperaba para los datos de un solo núcleo, no se detectó ARN mitocondrial. Los recuentos de lectura de gen × núcleo sin procesar se normalizaron usando SCTransform66, y las siete muestras se integraron con los anclajes de integración de Seurat, usando el Análisis de Correlación Canónica, y se agruparon usando Seurat67, como se implementó en el proceso de muestras múltiples CReSCENT68. Este proceso incluyó corrección del efecto por lotes, reducción de la dimensión de los datos, agrupación de células (Datos complementarios 6) y visualización utilizando la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP)69. Se asignaron identidades celulares a cada grupo, comparando los perfiles de expresión génica promedio para cada grupo con firmas de tipos de células cardíacas seleccionadas manualmente (Datos complementarios 7), utilizando el Análisis de variación del conjunto de genes (GSVA; Datos complementarios 8)70 como se describió anteriormente71. Las identidades de las células se compararon con marcadores conocidos. Los núcleos del grupo 7 se reagruparon y etiquetaron nuevamente, utilizando las mismas firmas de tipo celular y GSVA.

Analizamos la abundancia diferencial de núcleos en muestras enrolladas versus de control mediante dos métodos. Primero, agrupamos los números nucleicos en 3 muestras enrolladas y 3 controles (se excluyó una muestra enrollada debido a un número mucho mayor de núcleos de tejido adiposo en comparación con las demás; ver más abajo), y realizamos una prueba exacta de Fisher (FET) de la fracción de cada tipo de célula. En segundo lugar, realizamos análisis de regresión logística multinomial utilizando scCODA36 y Dirichlet Reg37,38. El primer método scCODA está disponible en el laboratorio de Theis (https://github.com/theislab/scCODA)36. ScCoda es un método bayesiano y utiliza una variante logit-normal continua del prior72 de losa y pico como método de selección de variables (tipo de célula), que identifica solo los grandes contribuyentes al cambio de composición celular. El segundo método DirichletReg (https://CRAN.R-project.org/package=DirichletReg, https://epub.wu.ac.at/4077/) se ha utilizado previamente para analizar la composición celular en biopsias intestinales de pacientes ulcerosos humanos. colitis37 y también se ha comparado con el paquete scCODA, tanto en la preimpresión como en el sitio de GitHub. Nuestro enfoque inicial se centró en 4 tipos de células: cardiomiocitos, fibroblastos, células endoteliales y adipocitos. La muestra LV_2_coiled fue atípica con la menor cantidad de núcleos totales, la mayor cantidad de adipocitos y la menor cantidad de cardiomiocitos. Adoptamos un enfoque conservador y tratamos esta muestra como un posible valor atípico que representa una región con un depósito de tejido adiposo, y la excluimos de las inferencias sobre cambios en la composición celular que podrían atribuirse a cambios secundarios al bajo flujo del corazón izquierdo.

Separamos los datos de snRNA-seq de todas las muestras en tres variedades. La variedad de cardiomiocitos contenía los grupos 10, 3 y 0. La variedad de fibroblastos contenía los grupos 2 y 1. La variedad endotelial contenía los grupos 15 y 5. Luego filtramos aún más los núcleos en la variedad de cardiomiocitos que no estaban dentro de la variedad. Inspeccionamos el UMAP con la función “DimPlot” en Seurat V467,73 y filtramos celdas con UMAP_1 > 5 y UMAP_2 < 6. Medimos trayectorias de pseudotiempo con Slingshot74, con estiramiento = 0 y extensión = “n”. Utilizamos los grupos 10, 2 y 15 como grupos iniciales para los grupos de cardiomiocitos, fibroblastos y endoteliales, respectivamente. Primero, eliminamos genes que no estaban designados con un símbolo genético. Luego utilizamos el paquete tradeSeq75 para estimar el número mínimo de nudos apropiados con la función "evaluateK"75 antes de ajustar un modelo aditivo general binomial negativo (nb-GAM) para cada gen con la función "fitGAM"75. Los 5.000 genes más variables también tenían nb-GAM instalados en cada condición para permitir diferencias en la expresión entre condiciones a lo largo del pseudotiempo. Identificamos genes cuya expresión está asociada con el pseudotiempo utilizando la función "associationTest"75, y genes que se expresaron diferencialmente entre condiciones utilizando la "conditionTest". Corregimos los valores p devueltos con estas funciones utilizando una tasa de descubrimiento falso (límite: valor p ajustado por FDR <0,05). Luego generamos mapas de calor en pseudotiempo de genes asociados y expresados ​​diferencialmente mediante la predicción de suavizadores para cada gen utilizando la función "predictSmooth"75. Los suavizadores se escalaron y luego se trazaron con la función pheatmap. Completamos el enriquecimiento de la vía de estos genes asociados y expresados ​​diferencialmente usando el siguiente comando:76 gprofiler(genes,”hsapiens”, ordenado = TRUE, src_filter = c(“GO:BP”, “REAC”, “KEGG”), custom_bg = genes_detectados, método_corrección = “fdr”)77 y trazado con ggplot2.

Se midieron genes expresados ​​diferencialmente específicos del grupo entre muestras enrolladas y de control, utilizando el método MAST, función "Buscar marcadores" dentro del paquete Seurat V4. Los genes se consideraron expresados ​​diferencialmente si el gen se detectaba en más del 10% de las células dentro de cualquier grupo y si el gen tenía un valor p ajustado por FDR <0,05. El enriquecimiento de la ruta de genes expresados ​​diferencialmente se completó con el paquete gProfileR R, usando el siguiente comando: gprofiler(genes,”hsapiens”,ordered = TRUE,src_filter = c(“GO:BP”,”REAC”,”KEGG”), custom_bg = genes detectados,correction_method =”fdr”).

Realizamos análisis de señalización celular utilizando el paquete CellChat R siguiendo sus flujos de trabajo publicados (https://github.com/sqjin/CellChat/tree/master/tutorial)78. Específicamente, dividimos el objeto Seurat en las dos condiciones "controles" y "enrollado", antes de extraer los datos necesarios para CellChat, siguiendo el tutorial "Interfaz con otros kits de herramientas de análisis unicelulares". Brevemente, cada conjunto de datos se convirtió en un objeto CellChat. La comunicación celular se estimó con las funciones "computeCommunProb" y "filterCommunication" contra la base de datos de ligando-receptor "CellChatDB.human". Los pares ligando-receptor se organizaron en vías de señalización utilizando la función "computeCommunProbPathway". Los objetos de Cellchat se fusionaron antes de que se calculara la comunicación celular compartida y específica de la condición con un enfoque de aprendizaje múltiple conjunto y similitud topológica utilizando las funciones "computeNetSimilarityPairwise", "netEmbedding" y "netClustering". Luego se visualizaron las vías de señalización conservadas y específicas de la condición con la función "netAnalysis_signalingRole_heatmap". Los pares ligando-receptor regulados diferencialmente se calculan con las funciones "identifyOverExpressedGenes" y "netMappingDEG" en CellChat.

Todo el procesamiento de datos para RNA-seq en masa, RNA-seq pequeño y snRNA-seq se realizó con paquetes estadísticos de código abierto utilizando parámetros predeterminados, a menos que se especifique lo contrario en los Materiales y Métodos. Después del procesamiento de los datos, los análisis estadísticos se realizaron en R-/4.0.0.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuencia están disponibles a través de ArrayExpress (números de acceso: E-MTAB-12327 y E-MTAB-12230) y el Broad Institute (SCP1994). Hay datos adicionales disponibles a través de https://doi.org/10.6084/m9.figshare.23511888.

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RRC cuenta con el apoyo del Centro Ted Rogers para la Investigación del Corazón, la familia Cockwell y el Centro Familiar del Corazón Labatt. MW cuenta con el apoyo del Programa de Cátedras de Investigación de Canadá. CC, LW y DS cuentan con el apoyo parcial de la subvención RGPIN-2019-07014 del NSERC para MDW; CC cuenta con el apoyo de una beca SickKids RESTRACOMP y DS cuenta con el apoyo de una beca de doctorado NSERC. SWS está financiado por la Cátedra Glaxo Smith Kline-CIHR de Ciencias del Genoma de la Universidad de Toronto y el Hospital para Niños Enfermos. Agradecemos al Dr. Timothy Regnault y al Sr. Brad Matushewski por su ayuda con el desarrollo de protocolos, estudios de ovejas y recolecciones de tejidos. Jannic Jaeggi creó la ilustración central.

Estos autores contribuyeron igualmente: Miriam S. Reuter, Dustin J. Sokolowski.

CGEn, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

Miriam S. Reuters

Centro de Genómica Aplicada, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

Miriam S. Reuter y Stephen W. Scherer

Genética y biología del genoma, Instituto de Investigación SickKids, Toronto, ON, Canadá

Miriam S. Reuter, Dustin J. Sokolowski, Cadia Chan, Liangxi Wang, Stephen W. Scherer y Michael D. Wilson

Departamento de Genética Molecular, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Dustin J. Sokolowski, Cadia Chan, Liangxi Wang, Stephen W. Scherer y Michael D. Wilson

Centro Oncológico Princess Margaret, Red Universitaria de Salud, Toronto, ON, Canadá

J. Javier Díaz-Mejía & Troy Cassava

Centro Fetal de Ontario, Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Mount Sinai, Toronto, ON, Canadá

Johannes Keunen, Greg Ryan, Edgar Jaeggi y Rajiv R. Chaturvedi

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Johannes Keunen y Greg Ryan

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Western University, Londres, ON, Canadá

Barbara la más libre

Instituto de Investigación en Salud Infantil, Londres, ON, Canadá

Barbara la más libre

Centro de Ciencias de la Salud de Londres, Victoria Hospital, Londres, ON, Canadá

Barbara la más libre

Departamento de Medicina de Laboratorio Pediátrico, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

David A. Chiasson

Departamento de Medicina de Laboratorio y Patobiología, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

David A. Chiasson

Centro McLaughlin, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Stephen W. Scherer

Labatt Family Heart Centre, División de Cardiología, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

Edgar Jaeggi y Rajiv R. Chaturvedi

Departamento de Pediatría, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Edgar Jaeggi y Rajiv R. Chaturvedi

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RRC, JK, B.dV., GR y EJ contribuyeron a la concepción o diseño del trabajo. RRC, MSR, JDM, DS, CC, LW, DAC, TK, SWS y MDW contribuyeron a la adquisición, análisis o interpretación de datos. RRC y MSR han redactado el manuscrito. Todos los autores han revisado y aprobado sustancialmente la versión enviada del manuscrito.

Correspondencia a Rajiv R. Chaturvedi.

Los autores declaran los siguientes intereses en competencia: SWS forma parte de los Comités Asesores Científicos de Diagnóstico de Poblaciones y Genómica Profunda, y es un asesor académico altamente citado de la Universidad Rey Abdulaziz. Los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Yifei Miao y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Kaoru Ito y Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Reuter, MS, Sokolowski, DJ, Javier Díaz-Mejía, J. et al. La disminución del flujo del corazón izquierdo en fetos de cordero causa hipoplasia del corazón izquierdo y remodelación del tejido profibrótico. Común Biol 6, 770 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05132-2

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Recibido: 04 de abril de 2022

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 22 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05132-2

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