La exposición crónica a temperaturas cálidas provoca una baja abundancia y calidad del esperma en Drosophila melanogaster

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12331 (2023) Citar este artículo

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La temperatura influye en la fertilidad masculina en todos los organismos; sin embargo, aún no se ha estudiado bien cómo las temperaturas subóptimas afectan la espermatogénesis en adultos. En un estudio reciente sobre la ovogénesis de Drosophila melanogaster, observamos una reducción drástica en la fertilidad de machos adultos expuestos a temperaturas cálidas (29 °C). Aquí, mostramos que los machos se vuelven infértiles a 29 °C debido a la baja abundancia y calidad del esperma. La baja abundancia de espermatozoides a 29 °C no se debe a una reducción del número de células madre de la línea germinal o de espermátidas, ya que esos números siguen siendo comparables entre 29 °C y el control de 25 °C. En particular, los machos a temperaturas frías de 18 °C y 29 °C tuvieron frecuencias igualmente aumentadas de defectos de individualización y elongación de las espermátidas que, considerando la alta abundancia de espermatozoides y la fertilidad masculina medida a 18 °C, indican que la espermatogénesis tiene una alta tolerancia a los defectos de elongación e individualización. . Curiosamente, la abundancia de espermatozoides a 29 °C disminuye abruptamente y sin evidencia de apoptosis a medida que pasan a la vesícula seminal cerca del final de la espermatogénesis, lo que apunta a la eliminación de los espermatozoides a través de un mecanismo desconocido. Finalmente, el esperma de los machos a 29 °C fertiliza los óvulos de manera menos eficiente y no soporta a los embriones más allá de la primera etapa de embriogénesis, lo que indica que la mala calidad del esperma es una causa adicional de infertilidad masculina a 29 °C.

La reproducción responde en gran medida a señales fisiológicas y externas1,2,3 como consecuencia de miles de millones de años de evolución, inicialmente de células individuales y más tarde de organismos multicelulares que tuvieron que producir progenie con éxito en el contexto de entornos en constante cambio4,5. Sin embargo, entre los efectos no deseados del rápido aumento de las temperaturas debido a la actividad humana6 se encuentran los impactos negativos en la reproducción de muchos organismos7,8,9,10,11,12,13,14,15. Los efectos sobre los insectos son particularmente preocupantes dada su limitada capacidad de termorregulación11,12,13,14,15 y su relevancia para la salud pública, económica y ecológica16.

Las temperaturas elevadas tienen efectos negativos bien documentados sobre la fertilidad masculina en muchas especies de Drosophila y otros insectos17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. 34. Por ejemplo, las larvas de Drosophila melanogaster que se desarrollan a 28-31 °C dan lugar a machos adultos con menor fertilidad17,19,21,22,23,24,26,30,31,32,33,34, como también ocurre para otros drosófilos20,25,27,29,35. La exposición a corto plazo de machos adultos de Drosophila a temperaturas superiores a 37 °C también reduce el número de descendencia36,37. Curiosamente, un estudio reciente que utilizó 43 especies de Drosophila demostró que las temperaturas que conducen a la esterilidad masculina adulta predicen su distribución global mejor que las temperaturas letales, lo que subraya el papel clave que la espermatogénesis puede tener en los procesos ecológicos13. En particular, se cree que las temperaturas subóptimas (a diferencia de las temperaturas extremas) utilizadas en experimentos de laboratorio se aproximan más a las condiciones del cambio climático en la naturaleza que aquellas que involucran temperaturas extremas11,15. A pesar de la gran cantidad de estudios que informan sobre los efectos de la temperatura en la fertilidad masculina15,22,24,26,27,28,29,31,33, aún no está claro cómo la exposición de los adultos a temperaturas subóptimas crónicas afecta la espermatogénesis en Drosophila.

Drosophila melanogaster es un sistema poderoso para investigar aspectos fundamentales de la espermatogénesis de amplia relevancia para muchos organismos, incluidos otros insectos3,38,39,40. La zona apical del testículo alberga células madre de la línea germinal (GSC) que se dividen mitóticamente y espermatogonias41,42 (Fig. 1). De cinco a nueve GSC que rodean el centro (un nicho somático) se dividen asimétricamente para autorrenovarse y generar un gonialblasto, que a su vez se divide cuatro veces con citocinesis incompleta para formar un quiste de línea germinal (rodeado por dos células de quiste somático) que contiene 16 espermatogonias que se convierten en espermatocitos primarios38,43. La meiosis y la espermiogénesis (es decir, la diferenciación de los espermatozoides) ocurren en la zona intermedia41 (Fig. 1A). Los espermatocitos primarios sufren dos divisiones meióticas para generar quistes de 64 células (es decir, 64 espermátidas haploides sincitiales). Sus núcleos sufren cambios morfológicos de redondos a hojas, canoas y, finalmente, agujas a medida que se convierten en espermátidas alargadas (Fig. 1); en canoa tardía, las histonas son reemplazadas por protaminas39,40. Por ejemplo, la protamina B (codificada por Mst35B) es esencial para una morfología nuclear adecuada44,45; Mst35B se transcribe en espermatocitos redondos, pero permanece reprimido traslacionalmente hasta la última etapa de la canoa44 (Fig. 1B). Después de la condensación nuclear, las espermátidas con forma de aguja se individualizan a través de un proceso dependiente de caspasas que involucra conos de individualización basados en actina que eliminan orgánulos y citoplasma innecesarios, formando un bulto quístico a medida que se mueven de la cabeza a la cola para desechar los restos en una bolsa de desechos en el extremo. final del quiste46,47. Después de la individualización, los espermatozoides resultantes se enrollarán en la zona terminal (también conocida como región de enrollamiento)41,48 (Fig. 1). Luego, los espermatozoides se desenrollan y se trasladan a la vesícula seminal, donde se almacenan hasta el apareamiento (Fig. 1). Recientemente hemos demostrado que los machos de Drosophila melanogaster expuestos crónicamente en su edad adulta a una temperatura subóptima de 29 °C (en contraste con la temperatura óptima de 25 °C) se vuelven estériles49. Sin embargo, aún se desconoce exactamente qué procesos de espermatogénesis se vieron afectados negativamente por las temperaturas cálidas.

Espermatogénesis de Drosophila melanogaster. (A) Diagrama de testículo simplificado (no a escala) que muestra diferentes etapas del desarrollo de las células germinales, con los núcleos de las células germinales mostrados en rojo. En la zona apical (amarilla), las células madre de la línea germinal (GSC) se dividen asimétricamente para formar gonialblastos (no mostrados) que se dividen aún más para formar espermatogonias interconectadas (en última instancia, en quistes de 16 células). En la zona intermedia (azul), los quistes de 16 espermatocitos primarios se someten a meiosis I y II para formar quistes de 64 células de espermátidas haploides que se someten a espermiogénesis. Estas espermátidas sincitiales primero comienzan a alargarse mientras sus núcleos experimentan compactación de cromatina y cambios morfológicos de redondos a hojas, canoas y, finalmente, agujas. Las espermátidas se individualizan con la ayuda de un complejo basado en actina (magenta), formando un bulto quístico; al final de la individualización, los restos de orgánulos y citoplasmáticos se desechan en una bolsa de desechos al final de las colas de las espermátidas, y cada espermatozoide queda encerrado en su propia membrana plasmática. En la zona terminal (gris), los haces de espermatozoides maduros inicialmente se enrollan y luego se liberan como espermatozoides desenrollados antes de transferirlos a la vesícula seminal (rosa claro) para su almacenamiento hasta la fertilización. (B) Imágenes que ilustran diferentes etapas de la espermatogénesis. Vasa (rojo), células germinales; fasciclina III (cian), células centrales; DAPI (blanco), núcleos; faloidina (magenta), actina; GFP (verde), Protamina B (etiqueta los núcleos de las células germinales que comienzan en la última etapa de la canoa) y Don Juan (etiqueta las colas de los espermatozoides). En la zona apical, las células centrales y las GSC están delineadas en amarillo y blanco, respectivamente. En la zona terminal, una punta de flecha indica el comienzo del área con espermatozoides enrollados, mientras que un asterisco indica espermatozoides desenrollados. Barras de escala, 20 μm.

Aquí, analizamos los efectos de la exposición crónica de machos adultos de Drosophila a temperaturas frías o cálidas sobre la espermatogénesis y mostramos que la esterilidad masculina a 29 °C es causada por una producción reducida de esperma y una baja calidad del esperma. La exposición crónica de los machos a 18 °C (frío) mejoró el mantenimiento de GSC, mientras que los machos a 25 °C y 29 °C tuvieron números de GSC similares. Sorprendentemente, a pesar del alto número de quistes y la fertilidad mantenida a 18 °C, los machos tanto a 18 °C como a 29 °C tuvieron mayores defectos de elongación e individualización, lo que indica una alta tolerancia de la espermatogénesis a este tipo de defectos. A 29 °C, el número de espermatozoides disminuyó drásticamente entre la zona terminal y la vesícula seminal sin signos de apoptosis, lo que sugiere que los espermatozoides se eliminan mediante un mecanismo aún desconocido al final de la espermatogénesis. Finalmente, mostramos que la menor cantidad de espermatozoides producidos después de la exposición crónica de los machos a 29 °C tiene una baja calidad, como lo indica su menor eficiencia de fertilización y su incapacidad para soportar la embriogénesis más allá de la etapa 1. Nuestros hallazgos proporcionan una base sólida para futuros estudios que aborden la función celular. y mecanismos moleculares que sustentan los efectos nocivos de las temperaturas cálidas en la producción de espermatozoides sanos.

Anteriormente demostramos que los machos “salvajes” de Drosophila yw mantenidos a 29 °C durante 20 días son casi 100% estériles49. Por lo tanto, preguntamos con qué rapidez los machos yw pierden su fertilidad a 29 °C y si se observa una pérdida similar de fertilidad a 29 °C en otras cepas "de tipo salvaje", a saber, w1118 y ProtB-GFP; dj-GFP (que produce espermatozoides marcados con GFP; ver Métodos). Incubamos parejas a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante dos, siete, 12 o 17 días, y luego sustituimos hembras vírgenes de dos días (previamente a 25 °C) por las hembras originales antes de un Incubación adicional de tres días a 29 °C, para un total de incubación de cinco, 10, 15 o 20 días a 29 °C para los machos (Fig. 2A). Para evaluar la fertilidad masculina, medimos las tasas de eclosión de los huevos puestos por estas hembras jóvenes en las últimas 24 h a 29 °C como se describió anteriormente49. Los machos yw y w1118 mostraron una caída drástica en la fertilidad después de 10 días de incubación a 29 °C en comparación con los machos a la temperatura de control de 25 °C (Fig. 2B, C). La fertilidad de ProtB-GFP; Los machos de dj-GFP se redujeron ligeramente a los cinco y 10 días, y se observó una caída más severa en momentos posteriores a 29 °C en relación con 25 °C (Fig. 2D). La fertilidad masculina se mantuvo similar o superior a 18 °C en comparación con 25 °C en la mayoría de los momentos, excepto en ProtB-GFP; Los machos dj-GFP tuvieron una fertilidad ligeramente menor a 18 °C en comparación con 25 °C a los 5 y 15 días (Fig. 2B-D), lo que posiblemente esté relacionado con diferencias de cepa26. No obstante, ProtB-GFP; Los machos de dj-GFP fueron consistentemente más fértiles a 18 °C que a 29 °C en todos los momentos (Fig. 2D). Estos resultados muestran que, si bien la exposición crónica a temperaturas frías no es perjudicial para la reproducción masculina, la exposición crónica de los machos a temperaturas cálidas provoca una reducción significativa de su fertilidad en un plazo de cinco a diez días.

Los machos expuestos a temperaturas cálidas se vuelven infértiles y tienen vesículas seminales con menos espermatozoides. (A) Diseño experimental para experimentos de tasa de eclosión en (B – D). Las parejas se incubaron a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante dos, siete, 12 o 17 días, después de lo cual las hembras originales fueron reemplazadas por hembras vírgenes de dos días (flechas) y se incubaron (con machos originales). durante tres días adicionales a 29 ° C (ver Métodos para más detalles). (B – D) Porcentaje de huevos eclosionados puestos por hembras dentro de las últimas 24 h de incubación con yw (B), w1118 (C) o w*; ProtB-GFP; machos dj-GFP (D). El número de huevos analizados se muestra encima de las barras. Los datos se muestran como media ± SEM de tres o cuatro experimentos independientes. *P <0,05, **P <0,01, ****P <0,0001, ANOVA unidireccional utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2). (E) Vesículas seminales que muestran diferentes abundancias de espermatozoides para ilustrar las categorías de 0 a 10 espermatozoides, +, ++ y +++ cuantificadas en (F). DAPI (blanco), núcleos. Barra de escala, 20 μm. (F) Frecuencias de vesículas seminales en diferentes categorías de abundancia de esperma de machos yw mantenidos a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante cinco, 10, 15 o 20 días. El número de vesículas seminales analizadas se muestra dentro de las barras. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. *P <0,05, ***P <0,001, ****P <0,0001, prueba de chi-cuadrado utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

La drástica reducción de la fertilidad masculina a 29 °C nos llevó a preguntarnos si se estaría produciendo menos esperma. Por lo tanto, cuantificamos la abundancia de esperma en las vesículas seminales de machos yw mantenidas a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante cinco, 10, 15 o 20 días (Fig. 2E, F). En los machos a 25 °C, la abundancia de esperma se mantuvo alta en todos los momentos, mientras que los machos a 18 °C tuvieron una menor abundancia a los cinco días, pero fueron comparables a los controles de 25 °C a partir de los 10 días (Fig. 2F). Por el contrario, cuando los machos se incubaron a 29 °C, la cantidad de espermatozoides se redujo significativamente en cinco días y, a los 20 días, más de la mitad de las vesículas seminales analizadas tenían solo de cero a diez espermatozoides (Fig. 2F). Estos resultados indican que la reducción de la producción de esperma explica parcialmente la reducción de la fertilidad de los machos a 29 °C.

Luego preguntamos si los cambios en el número de GSC en la zona apical o el desarrollo de espermátidas en la zona intermedia (Fig. 1) podrían explicar la reducción de la producción de espermatozoides a 29 °C. Contamos el número de GSC en machos mantenidos a diferentes temperaturas durante cinco, 10, 15 o 20 días. Los números de GSC disminuyeron a tasas similares en los machos a 25 °C o 29 °C, pero se mantuvieron más altos con el tiempo a 18 °C (Fig. 3A). No observamos una diferencia proporcional en el número de celdas centrales (Fig. 3B), lo que sugiere que las diferencias en los números de GSC son en gran medida independientes de los cambios en el tamaño del nicho. Estos resultados son paralelos a nuestros hallazgos para GSC femeninas a diferentes temperaturas49. Cuantificamos el número total de quistes de 64 células en cualquier etapa de diferenciación de espermátidas (Fig. 3C) a lo largo de la zona intermedia y descubrimos que eran similares a 25 °C y 29 °C (Fig. 3D). Curiosamente, el número de quistes de 64 células se mantuvo más alto a 18 °C con el tiempo, quizás en parte como consecuencia de números más altos de GSC (Fig. 3D; consulte también la Fig. S1 complementaria en Información complementaria 1 para ver imágenes representativas de ProtB-GFP; dj -GFP testículos a diferentes temperaturas). En conjunto, estos resultados demuestran que la menor producción de espermatozoides a 29 °C no se debe a cambios en el número de GSC o espermátidas en desarrollo.

Los machos a temperaturas frías mantienen un mayor número de células madre de la línea germinal y quistes de 64 células. (A, B) Número promedio de GSC (A) o células centrales (B) por testículo en machos yw mantenidos a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante cinco, 10, 15 o 20 días. Las imágenes muestran los ápices de los testículos de machos a 25 °C durante 5 días. Fasciclina III (cian), α-espectrina (cian), fusomas; células centrales; vasa (rojo), células germinales; DAPI (blanco), núcleos. GSC y las celdas centrales se describen en (A) y (B), respectivamente. Barra de escala, 15 μm. El número de testículos analizados se incluye en los Datos complementarios S1. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. *P <0,05, ***P <0,001, ANOVA de dos vías con interacción utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2). (C) Ejemplos de quistes de 64 células en diferentes etapas de espermiogénesis a partir de muestras utilizadas para la cuantificación en (D). DAPI (blanco), núcleos; faloidina (magenta), actina; GFP (verde), Protamina B (etiqueta los núcleos de las células germinales que comienzan en la última etapa de la canoa) y Don Juan (etiqueta las colas de los espermatozoides). Barra de escala, 10 μm. (D) Número promedio de quistes de 64 células por testículo en w*; ProtB-GFP; Los machos dj-GFP se mantuvieron a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante cinco o 15 días. El número de testículos analizados se muestra dentro de las barras. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. **P <0,01, ****P <0,0001, ANOVA unidireccional utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Teniendo en cuenta que el número de quistes de 64 células no se vio afectado a 29 °C, nos preguntamos si los defectos en la espermiogénesis podrían explicar la reducción del número de espermatozoides en las vesículas seminales. Notamos espermátidas atípicas a lo largo de los testículos en todas las temperaturas, incluidas las etapas redonda, foliar y canoa temprana que expresan prematuramente protamina B (es decir, "ProtB prematura"), quistes con "núcleos dispersos" y espermatozoides maduros ubicados anormalmente más anteriormente (Fig. 4A). ). Curiosamente, el porcentaje general de testículos que contenían espermátidas defectuosas fue significativamente elevado en los machos mantenidos a 18 °C o 29 °C en relación con 25 °C (Fig. 4B), y los defectos predominantes fueron "ProtB prematuro" y "núcleos dispersos" ( Figura 4C-E). En vista de la abundancia normal de espermatozoides a 18 °C (Fig. 2E, F), el aumento similar en el número de testículos con espermátidas anormales a 18 °C y 29 °C sugiere que los defectos de las espermátidas no explican completamente la disminución de espermatozoides. abundancia en vesículas seminales de machos crónicamente expuestos a 29 °C, aunque no podemos descartar diferencias más sutiles entre defectos de 18 °C y 29 °C. Estos resultados muestran además que los machos adultos pueden tolerar altos niveles de defectos de diferenciación de espermátidas manteniendo al mismo tiempo la producción de esperma y la fertilidad normales. En consecuencia, los defectos que ocurren naturalmente durante la espermatogénesis se observan comúnmente en el líquido seminal humano50. Aunque otro estudio informó una disminución de la fertilidad de los machos adultos de Drosophila a 18 °C, esas moscas también habían sido criadas a 18 °C26, y se ha demostrado que el desarrollo a 17 °C reduce la fertilidad de los adultos34.

La exposición crónica a 18 °C o 29 °C provoca una mayor incidencia de defectos de la espermiogénesis. (A) Imágenes que muestran ejemplos de un quiste normal de espermátidas (panel superior) o grupos de espermátidas que muestran expresión prematura de protamina B o núcleos dispersos (paneles centrales), o espermatozoides maduros anormalmente localizados (panel inferior). DAPI (blanco), núcleos; faloidina (magenta), actina; GFP (verde), Protamina B (etiqueta los núcleos de las células germinales que comienzan en la última etapa de la canoa) y Don Juan (etiqueta las colas de los espermatozoides). Barras de escala, 20 μm. (B – E) Porcentaje de testículos de w*; ProtB-GFP; Machos dj-GFP mantenidos a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante cinco o 15 días mostrando cualquier defecto (B), expresión prematura de protamina B en estadios redondos, de hoja o de canoa temprana (C), núcleos dispersos ( D), o espermatozoides anormalmente localizados (D). El número de testículos analizados se muestra dentro de las barras en (A). Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. *P <0,05, **P <0,01, ****P <0,0001, ANOVA unidireccional utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Para evaluar si se podrían eliminar grandes cantidades de espermatozoides durante la transferencia de la zona intermedia a la zona terminal a 29 °C, medimos el tamaño de la zona terminal en machos expuestos a diferentes temperaturas durante cinco o 15 días (Figs. 1, 5A). ). El área de la zona terminal fue comparable a todas las temperaturas en cinco días (Fig. 5B). A los 15 días, no hubo diferencias significativas en el tamaño de la zona terminal en los machos a 25 °C o 29 °C (Fig. 5B). La zona terminal era más grande en los machos a 18 °C (Fig. 5B), lo que coincide con su mayor número de quistes espermátidos (Fig. 3C, D). El tamaño normal de la zona terminal en machos de 29 °C (Fig. 5A, B) y la drástica reducción en la abundancia de espermatozoides en sus vesículas seminales (Fig. 2E, F) apoyan la conclusión de que los espermatozoides se eliminan durante su transición entre la zona terminal. zona y la vesícula seminal.

Los machos expuestos a temperaturas cálidas tienen zonas terminales de tamaño normal y muestran un número normal de células apoptóticas en la zona apical. (A) Zona terminal en el testículo desde aw*; ProtB-GFP; dj-GFP macho. Faloidina (magenta), actina; GFP (verde), Protamina B (núcleos de espermatozoides) y Don Juan (colas de espermatozoides). La zona terminal está delineada en amarillo como se hizo para la cuantificación (ver "Métodos"). La punta de flecha indica el comienzo de la región de la zona terminal que contiene quistes enrollados. Barra de escala, 20 µm. (B) Área promedio de la zona terminal en w*; ProtB-GFP; Los machos dj-GFP se mantuvieron a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante cinco o 15 días. El número de zonas terminales analizadas se muestra dentro de las barras. Los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes. *P <0,05, ANOVA unidireccional utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2). (C) Ápice del testículo que muestra quistes de espermatogonias moribundas (puntas de flecha). DAPI (blanco), núcleos; Apoptag (verde), células germinales moribundas; α-espectrina (magenta), fusomas (es decir, orgánulos especializados presentes en las primeras células germinales). El asterisco indica el centro. Barra de escala, 20 μm. (D) Número de quistes positivos para Apoptag por testículo de machos yw incubados durante cinco o 15 días a 18 °C, 25 °C o 29 °C. El número de testículos analizados se muestra dentro de las barras. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. No hay diferencias estadísticamente significativas, ANOVA unidireccional utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Para comprobar si los espermatozoides se eliminan por apoptosis a 29 °C, teñimos los testículos utilizando un ensayo TUNEL (Apoptag), que marca las roturas del ADN para la detección de células apoptóticas, incluidos los espermatozoides51. Observamos números estadísticamente similares de quistes positivos para Apoptag en la zona apical (ver Fig. 1) de todos los testículos independientemente de la temperatura, con números más altos a los 15 días en comparación con los cinco días (Fig. 5C, D). De hecho, las células germinales apoptóticas se observan con frecuencia en la zona mitótica, ya que se eliminan espontáneamente antes de entrar en la meiosis52,53. En marcado contraste, no observamos quistes positivos para Apoptag en ninguna de las etapas posteriores (es decir, zona intermedia, zona terminal y vesícula seminal; ver Fig. 1) en ninguno de los testículos analizados de hombres a cualquier temperatura (n = 41 a 55 testículos (ver Fig. 5D). Estos resultados sugieren que la eliminación de espermatozoides entre la zona terminal y la vesícula seminal a 29 °C se produce mediante un mecanismo independiente de la apoptosis, lo que explica la reducción de los niveles de espermatozoides al final de la espermatogénesis.

La fuerte caída en la fertilidad masculina a 29 °C (Fig. 2A-D) se explica sólo parcialmente por la reducción en la abundancia de espermatozoides en sus vesículas seminales (Fig. 2E, F). Por ejemplo, los machos yw mantenidos a 29 °C durante 20 días son completamente estériles (Fig. 2B) a pesar de que un porcentaje significativo de vesículas seminales todavía contienen espermatozoides en estos machos (Fig. 2F). Las temperaturas elevadas pueden provocar una disminución de la motilidad de los espermatozoides tanto en mamíferos54,55 como en insectos27,35,56. Por lo tanto, probamos si los machos a 29 °C podían transferir esperma desde sus vesículas seminales a las espermatecas (uno de los órganos de almacenamiento de esperma en las hembras57) aprovechando el esperma verde de ProtB-GFP; machos dj-GFP58. ProtB-GFP; Los machos dj-GFP se mantuvieron a 18 °C, 25 °C o 29 °C durante dos, siete, 12 o 17 días. Se sustituyeron hembras vírgenes yw de dos días de edad por hembras anteriores durante tres días adicionales de incubación a 29 ° C (ver Fig. 2A), después de lo cual cuantificamos la presencia de espermatozoides en sus espermatecas. Casi todas las hembras emparejadas con machos previamente incubados a 18 °C o 25 °C (independientemente del momento) tenían espermatozoides en una o ambas espermatecas (Fig. 6A, B). Por el contrario, las hembras emparejadas con machos a 29 °C mostraron una reducción progresiva de las espermatecas que contienen espermatozoides con el tiempo (Fig. 6B), lo que coincide con los resultados de abundancia de espermatozoides de la vesícula seminal (Fig. 2E, F). En particular, el 100% de las espermatecas con espermatozoides mostraron una motilidad normal de los espermatozoides independientemente de la temperatura (Tabla complementaria S1 y Películas complementarias S1-S3 en la Información complementaria 1), lo que sugiere además que la transferencia de espermatozoides de machos a hembras no se ve afectada específicamente por la temperatura. Estos hallazgos descartan problemas con la motilidad o la transferencia de espermatozoides como causas potenciales de la grave pérdida de fertilidad masculina a 29 °C.

Los espermatozoides de los machos expuestos a temperaturas cálidas tienen una eficiencia de fertilización reducida y no apoyan el desarrollo embrionario temprano. (A) Ejemplos de pares de espermatecas en los que ambos (panel izquierdo), solo uno (panel central) o ninguno (panel derecho) contienen espermatozoides transferidos desde w*; ProtB-GFP; Machos dj-GFP utilizados para la cuantificación en (B). GFP (verde), Protamina B (núcleos de espermatozoides) y Don Juan (colas de espermatozoides); DAPI (azul), núcleos de espermateca. Las flechas indican espermatecas que contienen espermatozoides. Las puntas de flecha indican espermatecas vacías. Barra de escala, 50 µm. (B) Porcentaje de pares de espermatecas en los que ninguna, una o ambas espermatecas contienen espermatozoides. El número de pares de espermatecas analizados se muestra dentro de las barras. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. *P <0,05, ****P <0,0001, prueba de Chi-cuadrado utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2). (C) Ejemplos de huevos de recolección de 12 h utilizados para la cuantificación en (D). Para la recolección de huevos, las parejas de yw se incubaron durante 17 días a 25 °C o 29 °C, después de lo cual las hembras originales fueron reemplazadas por hembras vírgenes de dos días y se incubaron (con los machos originales) durante tres días adicionales a 29 °C. . Las imágenes muestran un óvulo no fertilizado que contiene una roseta (delineada por un cuadrado y ampliada en el recuadro); embrión en etapa 1, que contiene dos núcleos; embrión en etapa 2, que contiene múltiples núcleos ubicados en el centro; Material muerto y amorfo sin núcleos reconocibles. Barra de escala, 50 µm. (D) Porcentaje de huevos de la colección de 12 h que representan huevos no fertilizados, embriones en etapa 1, embriones en etapa 2 o posteriores o material muerto. El número de embriones analizados se muestra dentro de las barras. Los datos representan un gran experimento. ****P <0,0001 (para cada una de las cuatro categorías), prueba de Chi-cuadrado utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

A continuación, planteamos la hipótesis de que la caída en la fertilidad masculina más allá de lo que se puede atribuir a la reducción de la abundancia de espermatozoides podría ser el resultado de una mala calidad del esperma (por ejemplo, fertilización ineficiente y/o capacidad reducida para apoyar el desarrollo embrionario). Para probar esta hipótesis, incubamos machos de yw (con hembras) a 25 °C o 29 °C durante 17 días, momento en el cual hembras vírgenes de dos días de edad (previamente a 25 °C) fueron sustituidas por hembras originales antes de incubación durante tres días adicionales a 29 ° C (ver Fig. 2A). Luego analizamos los óvulos recolectados en las últimas 12 h a 29 ° C para determinar el estado de fertilización y el desarrollo embrionario utilizando DAPI para etiquetar los núcleos (Fig. 6C). Los huevos no fertilizados se identificaron basándose en la “roseta” formada por el pronúcleo femenino condensado y los cuerpos polares cerca de su superficie59,60. Los embriones en desarrollo se estadificaron como se describe61,62; por ejemplo, la etapa 1 comienza después de la fertilización y termina una vez que se han completado las dos primeras divisiones cigóticas, mientras que las divisiones 3 a 8 ocurren durante la etapa 261,62. Los huevos que contenían material amorfo sin núcleos reconocibles se clasificaron como "muertos". Aproximadamente el 3,5% de los huevos puestos por hembras incubadas con machos a 25 °C tenían "rosetas", mientras que esa frecuencia aumentó al 18% para las hembras emparejadas con machos a 29 °C (Fig. 6C, D; Tabla complementaria S2 en Información complementaria 1). lo que sugiere que los espermatozoides a 29 °C fertilizan los óvulos de manera menos eficiente. Sorprendentemente, todos los huevos restantes de hembras incubadas con machos a 29 °C contenían embriones en etapa 1 (16%) o estaban "muertos" (66%), mientras que la mayoría de los huevos de control contenían embriones en varias etapas de desarrollo (77%) (Fig. 6C, D; Tabla complementaria S2 en Información complementaria 1). Estos resultados muestran que el esperma de machos mantenido a 29 °C durante 20 días no puede soportar la embriogénesis más allá de la etapa 1.

El cambio climático antropomórfico ha provocado desastres naturales, fenómenos meteorológicos extremos y degradación ambiental6, lo que supone un riesgo importante para la reproducción de muchos organismos, incluidos los humanos8,10. Los insectos enfrentan un desafío mayor debido a su limitada capacidad de termorregulación11,12,13,14,15. De hecho, las temperaturas subletales han comenzado a alterar la distribución de los insectos a través de efectos sobre su fertilidad, y estos efectos son fuertes predictores de la extinción de los insectos11,13,14. A pesar de la vasta literatura sobre cómo la temperatura afecta la gametogénesis larvaria17,19,21,22,23,24,26,29,30,31,32,33,34, los efectos celulares de la exposición crónica de insectos adultos a temperaturas subóptimas se han mantenido en gran medida poco estudiado. Complementando nuestros hallazgos recientes sobre cómo la temperatura afecta la ovogénesis adulta49, este estudio muestra que la exposición crónica de los machos al frío (18 °C) no afecta su fertilidad, mientras que la temperatura cálida (29 °C) conduce a una reducción significativa en la abundancia y calidad del esperma. (Figura 7). Descubrimos que la baja abundancia de espermatozoides se debe a la eliminación de los espermatozoides a través de un mecanismo desconocido al final de la espermatogénesis (antes de la transferencia a las vesículas seminales) y que los espermatozoides son ineficaces para fertilizar los óvulos y no pueden sustentar el desarrollo del embrión. Nuestros hallazgos proporcionan una base para futuros estudios en Drosophila melanogaster para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la eliminación de los espermatozoides y la incapacidad de los espermatozoides para sustentar el embrión temprano cuando los machos están expuestos crónicamente a temperaturas cálidas.

Estos hallazgos también contribuyen a una comprensión detallada de los efectos de las temperaturas subóptimas en la espermatogénesis de los insectos en general. Por ejemplo, las temperaturas cálidas también reducen la abundancia de esperma adulto y la fertilidad de otro modelo de insecto, Tribolium castaneum28. En varias especies de Drosophila y una especie de avispa, la exposición a temperaturas cálidas durante las etapas larvales da como resultado adultos tardíos con menos espermatozoides en sus vesículas seminales y una fertilidad reducida29,31,35,63. Nuestros nuevos datos se suman a las discusiones recientes que destacan la urgencia de investigar cómo las temperaturas subletales afectan la reproducción de los insectos6,11,13,14,15.

Más allá de los insectos, una comprensión más profunda de cómo responde la espermatogénesis de Drosophila melanogaster a las temperaturas cálidas es potencialmente relevante para los mamíferos. A pesar de ser de sangre caliente, los mamíferos son susceptibles a altas temperaturas ambientales, fiebre, insolación y trastornos termorreguladores64,65. Los testículos son particularmente sensibles, ya que la temperatura testicular normalmente se mantiene entre 2 y 4 °C por debajo de la temperatura central para garantizar una espermatogénesis óptima50. De hecho, el estrés por calor resultante del cambio climático es un factor importante para la disminución de la fertilidad y la producción del ganado, y la alteración por calor de la termorregulación testicular reduce drásticamente la fertilidad bovina y la calidad del semen66. Múltiples estudios en ratones, ratas y ganado han demostrado que el estrés por calor paterno reduce la abundancia de espermatozoides y las tasas de embarazo50,55,67,68,69. En los seres humanos, las altas temperaturas tienen múltiples efectos sobre la espermatogénesis, incluidos cambios morfológicos, disminución del recuento de espermatozoides y aumento del daño en el ADN54,55,64,65,68,69,70,71,72. Estudios futuros que comparen hallazgos específicos en Drosophila y mamíferos nos ayudarían a comprender el grado de similitud en cómo los diferentes sistemas manejan el estrés de las temperaturas elevadas.

Una pregunta importante que plantean nuestros estudios es cómo se eliminan los espermatozoides entre la zona terminal y la vesícula seminal en respuesta a la temperatura cálida en Drosophila. En condiciones normales, se han propuesto mecanismos de control de calidad para eliminar las espermátidas defectuosas durante el alargamiento y la individualización46 o el enrollado48. Sin embargo, en el caso de temperaturas cálidas, aún se desconoce si los espermatozoides se eliminan aleatoriamente o si actúa un tercer mecanismo de control de calidad en la transición entre la zona terminal y la vesícula seminal.

La baja calidad del esperma a 29 °C podría ser el resultado de cualquier número de defectos en los primeros eventos que rodean la fertilización73. Después de la entrada y activación de los espermatozoides, el núcleo del espermatozoide, con forma de aguja, rico en protamina y altamente condensado, debe convertirse en un pronúcleo masculino capaz de replicar el ADN. Este proceso implica la eliminación de protaminas seguida del ensamblaje de nucleosomas de todo el genoma paterno a partir de histonas maternas y factores de ensamblaje de nucleosomas. Las marcas de acetilación y metilación de histonas también se distribuyen diferencialmente a lo largo de los cromosomas paternos y maternos, y el ensamblaje de la envoltura pronuclear masculina se produce mediante el inicio de la migración pronuclear73. Los centríolos de esperma combinados con material pericentriolar del óvulo generan centrosomas cigóticos que son cruciales para la formación del áster de esperma, que a su vez es necesario para la migración del pronúcleo femenino hacia el pronúcleo masculino. Una vez que los pronúcleos se yuxtaponen, comienza la primera división cigótica, iniciando la transición a ciclos embrionarios rápidos73. Nuestros hallazgos de que los espermatozoides de machos a 29 °C no son capaces de soportar la embriogénesis más allá de la etapa 1 sugieren que cualquiera de estos procesos tempranos podría verse afectado cuando los espermatozoides se desarrollan a temperaturas cálidas. Los estudios futuros que examinen cuidadosamente los primeros eventos relacionados con la fertilización y los actores moleculares conocidos serán fundamentales para identificar el motivo de la mala calidad del esperma a 29 °C. Una comprensión más profunda de cómo las temperaturas subóptimas afectan la reproducción de los insectos puede allanar el camino para el desarrollo y la adopción de intervenciones apropiadas y la mejora de las políticas de salud pública, agrícolas y ambientales.

Las poblaciones de moscas se mantuvieron a 21-23 °C en un medio estándar que contenía 4,64% p/v de harina de maíz, 5,8% v/v de melaza, 1,74% p/v de levadura y 0,93% p/v de agar. y1 ac1 w1118 (aquí denominado yw), w1118 y w*; ProtaminaB-eGFP/CyO; dj-GFP/TM3, Sb158 se obtuvieron del Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu). Para la mayoría de los experimentos, se incubaron adultos de cero a un día de edad en medio estándar suplementado con levadura seca a 18 °C (± 0,5), 25 °C (± 0,5) o 29 °C (± 0,5) durante cinco años. 10, 15 o 20 días a ≥ 80 % de humedad en 12 h: ciclos de luz y oscuridad de 12 h (incubadoras Darwin Chambers), excepto donde se indique lo contrario. Se cambió la comida y se controló diariamente la temperatura y la humedad.

La fertilidad masculina se midió en función de las tasas de eclosión de huevos. Para medir las tasas de eclosión, incubamos 10 machos de diferentes genotipos de cero a un día de edad con 10 hembras de año durante dos, siete, 12 o 17 días a 18 °C, 25 °C o 29 °C en viales. Luego se sustituyeron las hembras más viejas por hembras vírgenes de dos días de edad (previamente a 25 °C) y se incubaron con los machos originales durante tres días adicionales a 29 °C para un total de cinco, 10, 15 o 20 -días de incubación, respectivamente (ver Fig. 2A) en frascos perforados cerrados con placas de melaza/agar cubiertas por una fina capa de pasta de levadura húmeda, como se describió anteriormente49. Para las tasas de eclosión, los huevos se recolectaron durante las últimas 24 h de incubación a 29 °C. Se colocaron alrededor de 100 huevos en grupos de 10 en placas de melaza que contenían un poco de pasta de levadura en el centro y se incubaron en una cámara húmeda (plato de Pyrex cubierto y forrado con toallas de papel húmedas) durante 24 h a 25 °C. Los huevos no eclosionados se contaron y se restaron del total para calcular el número de huevos eclosionados. Los datos de tres (para machos yw y w1118) o cuatro (para machos ProtB-GFP; machos dj-GFP) se analizaron estadísticamente utilizando ANOVA unidireccional (GraphPad Prism) con 25 °C como control (Información complementaria 2).

Para el análisis del desarrollo embrionario, se prepararon adultos de yw como se describió anteriormente, excepto que los huevos se recolectaron durante las últimas 12 h de incubación a 29 °C (solo durante el período de 20 días) y se procesaron inmediatamente como se describió anteriormente74, con modificaciones menores. . Brevemente, los huevos se enjuagaron con agua destilada y se descorionaron con lejía al 50% durante dos minutos. Después de lavar con agua destilada, se agitaron vigorosamente durante dos minutos en heptano:metanol 1:1. Después de tres lavados en metanol, las muestras se fijaron durante la noche a 4 °C en metanol y se rehidrataron gradualmente en PBS (NaH2PO4/NaHPO4 10 mM y NaCl 175 mM (pH 7,4). Después de cinco minutos de incubación en PBST (PBS más Triton X al 0,1%). -100), los embriones se montaron en Vectashield que contenía DAPI (Vector Labs) para microscopía (ver más abajo). Los datos de un experimento grande se sometieron a una prueba de Chi-cuadrado (Microsoft Excel) (Información complementaria 2).

Los testículos se diseccionaron en medio de Grace, se fijaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una solución fijadora [5,3% de formaldehído (Ted Pella) en medio de Grace], se enjuagaron y lavaron tres veces durante 15 minutos cada uno en PBST. Después de una hora de incubación en una solución de bloqueo [5 % de suero de cabra normal (MP Biochemicals) más 5 % de albúmina sérica bovina (Sigma) en PBST], los testículos se incubaron durante la noche a 4 °C en los siguientes anticuerpos primarios diluidos en una solución de bloqueo: monoclonal de ratón. anti-α-espectrina (3A9) [Banco de Hibridomas de Estudios de Desarrollo (DSHB), 1:20]; anti-Fasciclina III monoclonal de ratón (7G10) (DSHB, 1:50); y anti-vasa monoclonal de rata (DSHB, 1:20). Los testículos se enjuagaron y lavaron como se indicó anteriormente y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o 568 (Molecular Probes, 1:400) en una solución de bloqueo. Para el análisis de la espermiogénesis, testículos de ProtB-GFP; Se diseccionaron, fijaron, lavaron (como anteriormente) machos adultos de dj-GFP y se incubaron durante 20 minutos en faloidina 568 5U/ml (Invitrogen) en PBS a temperatura ambiente y, en su lugar, se protegieron de la luz. Espermatecas de hembras de yw incubadas con ProtB-GFP; Los machos de dj-GFP se diseccionaron y fijaron como se indicó anteriormente. Todas las muestras se enjuagaron, se lavaron dos veces durante 15 minutos cada una en PBST y se montaron en Vectashield que contenía DAPI (Vector Labs). Todas las imágenes se recopilaron en un sistema confocal LSM 900 utilizando el detector Airyscan 2 integrado y el modo Airyscan SR correspondiente (Microscopía ZEISS) y se procesaron con las utilidades de procesamiento Airyscan estándar del software ZEN Blue 3.5 (Microscopía ZEISS) para lograr lecturas de superresolución.

Se utilizó el kit de detección de apoptosis in situ directa con fluoresceína ApopTag (S7160, Millipore Sigma) para identificar las células moribundas como se describió anteriormente49,53. Los datos de cuatro experimentos independientes se sometieron a ANOVA unidireccional (GraphPad Prism), utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Las células centrales se identificaron basándose en la tinción positiva para Fasciclina III, y las GSC se identificaron como células vasa positivas que rodean inmediatamente el centro42. Los datos de cuatro experimentos independientes se sometieron a ANOVA de dos vías con interacción (GraphPad Prism), utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2). El número total de quistes de 64 células en todas las etapas de desarrollo (desde espermátidas redondas hasta las de aguja; ver Fig. 3C) se contó a lo largo de los testículos. Se utilizaron los mismos testículos para la cuantificación de los defectos de elongación e individualización y los espermatozoides maduros mal localizados descritos en los resultados. Los datos de cuatro experimentos independientes se sometieron a ANOVA unidireccional (GraphPad Prism), utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Identificamos la zona terminal en función de la presencia de quistes enrollados al principio y el borde con la vesícula seminal al final (ver Fig. 5A y Fig. Suplementaria S1 en Información complementaria 1). Delineamos la zona terminal en la sección óptica central (para la sección transversal más grande) usando la selección a mano alzada de ImageJ (Fiji) y medimos su área usando la herramienta Medir. Los datos de tres experimentos independientes se sometieron a ANOVA unidireccional (GraphPad Prism), utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Cuantificamos la abundancia de espermatozoides en vesículas seminales de testículos teñidos con DAPI (ver Fig. 2E). Para clasificar cada vesícula seminal en una categoría específica (0–10, +, ++ o +++), examinamos cuidadosamente cada vesícula seminal teñida con DAPI en todo el plano Z utilizando el objetivo de 20 × en el confocal LSM 900. microscopio. En la categoría "0-10", las vesículas seminales contenían 10 o menos espermatozoides (y ambos "lados" del epitelio de la vesícula seminal se observaron típicamente en el mismo plano focal); en la categoría "+", las vesículas seminales no tenían suficientes espermatozoides para llenar el espacio entre ambos "lados" del epitelio de la vesícula seminal (y se podían observar porciones más pequeñas de ambos "lados" del epitelio de la vesícula seminal en la misma zona focal). avión); en la categoría "++", había suficientes espermatozoides para llenar completamente el espacio entre ambos "lados" de la vesícula seminal, pero la vesícula aún no estaba completamente distendida; en la categoría "+++", la vesícula seminal estaba tan llena de espermatozoides que abultaba y tenía una apariencia más redondeada. Para la cuantificación de la vesícula seminal, los datos de cuatro experimentos independientes se sometieron a una prueba de Chi-cuadrado (Microsoft Excel), utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Modelo de cómo la exposición crónica a temperaturas cálidas, pero no frías, causa infertilidad en hombres adultos en Drosophila melanogaster. La exposición crónica de machos adultos a temperaturas frías (18 °C) o cálidas (29 °C) aumenta la incidencia de defectos de elongación y individualización de las espermátidas a pesar de la abundancia y calidad normales del esperma a 18 °C. En los machos a 18 °C, el número de GSC y quistes de 64 células es mayor que a 25 °C. Por el contrario, los machos a 29 °C se vuelven infértiles como resultado de una combinación de reducción del número y la calidad del esperma. La abundancia de espermatozoides se reduce a 29 °C mediante un proceso desconocido e independiente de la apoptosis de eliminación de espermatozoides en la transición entre la zona terminal y la vesícula seminal. Esta eliminación de espermatozoides puede ser aleatoria o representar un proceso de control de calidad.

Cuantificamos el porcentaje de hembras en las que ambas espermatecas tenían espermatozoides, solo una espermateca tenía espermatozoides o ninguna espermateca tenía espermatozoides; cualquier espermateca con menos de 10 espermatozoides se consideró sin espermatozoides. Para evaluar la motilidad de los espermatozoides, las espermatecas recién disecadas se transfirieron a un portaobjetos con medio de Grace y se visualizaron inmediatamente utilizando un AxioZoom.V16 (microscopía ZEISS). Las muestras se analizaron utilizando el objetivo Plan Z 1 ×, la lámpara X-Cite Xylis, el reflector 38 HE eGFP y Exc. 450–490 nm/Em. Filtros de 500 a 550 nm. Los videos fueron grabados por Axio 712 mono a través del software ZEN Blue 3.5 (ZEISS Microscopy). Para la cuantificación de la espermateca, los datos de cuatro experimentos independientes se sometieron a una prueba de Chi-cuadrado (Microsoft Excel), utilizando 25 °C como control (Información complementaria 2).

Todos los datos brutos de este estudio están disponibles previa solicitud.

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Agradecemos al Bloomington Stock Center (Institutos Nacionales de Salud P400D018537) por las existencias de Drosophila y al Developmental Studies Hybridoma Bank por los anticuerpos. Agradecemos a los miembros de la DD-B. laboratorio para discusiones útiles. Agradecemos a Rodrigo Nunes y Alicia Williams por la lectura cuidadosa del manuscrito y sus útiles sugerencias de edición. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01 GM069875 (DD-B.), R01 GM125121 (DD-B.) y R35 GM140857 (DD-B.) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). ACPG cuenta con el apoyo de fondos del Instituto Morgridge de Investigación.

Departamento de Genética, Universidad de Wisconsin–Madison, Madison, WI, 53706, EE. UU.

Ana Caroline P. Gandara & Daniela Drummond-Barbosa

Instituto Morgridge de Investigación, Madison, WI, 53706, EE. UU.

Ana Caroline P. Gandara & Daniela Drummond-Barbosa

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Conceptualización: ACPG, DD-B.; Metodología: ACPG, DD-B.; Validación: ACPG; Análisis formal: ACPG; Investigación: ACPG; Redacción: borrador original: ACPG, DD-B.; Redacción: revisión y edición: ACPG, DD-B.; Visualización: ACPG; Supervisión: DD-B.; Administración de proyectos: DD-B.; Adquisición de financiación: DD-B.

Correspondencia a Daniela Drummond-Barbosa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Gandara, ACP, Drummond-Barbosa, D. La exposición crónica a temperaturas cálidas provoca una baja abundancia y calidad de esperma en Drosophila melanogaster. Representante científico 13, 12331 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39360-7

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Recibido: 18 de abril de 2023

Aceptado: 24 de julio de 2023

Publicado: 30 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39360-7

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